铅离子环境污染中直接竞争酶联免疫检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于直接竞争酶联免疫法铅离子检测试剂盒，包括：包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；质量浓度为20～50μg/mL的酶标Pb‑ITCBE鳌合物半抗原；质量浓度为10～20μg/mL的抗铅离子单克隆抗体溶液；所述抗铅离子单克隆抗体溶液由Pb‑ITCBE‑cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；1.0～3.0mol/L的终止液；样品稀释液；底物显色液；洗涤液；铅离子标准品溶液；质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。本发明专利技术提供试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时具有检测时间短的优点。

Reagent kit for detecting lead ion based on direct competition enzyme-linked immunosorbent assay and application thereof

The present invention provides a method based on direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay kit for detection of lead ion, including: coated with Goat anti mouse IgG two anti detection plate, the detecting plate vacuum sealed packaging; the Sheep anti mouse anti IgG two package is a concentration of 50 to 200 mu g/mL; concentration 20 ~ 50 g /mL Pb ITCBE ELISA chelate hapten; the concentration of 10 ~ 20 g/mL anti lead monoclonal antibody ion solution; the anti lead monoclonal antibody solution by ion Pb ITCBE cBSA immunized Balb/C mice were prepared; 1 ~ 3.0mol/L stop solution sample dilution;; chromogenic substrate liquid; washing liquid; lead ion standard solution; mass concentration is 10 ~ 20mg/mL EDTA solution. The kit provided by the invention has the advantages of high sensitivity and strong specificity, and has the advantages of short detection time simultaneously.

【技术实现步骤摘要】
一种基于直接竞争酶联免疫法检测铅离子试剂盒及其应用
本专利技术属于环境检测
，具体涉及一种基于直接竞争酶联免疫法检测铅离子试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
微量铅元素是有机体必需的金属微量元素之一。随着人类对铅的开采、冶炼、加工及商业制造的增多，大量的铅以不同的形式进入自然界，并随着生物链的传递而进入生物圈。由于铅具有生物放大效应和不易被代谢转移等特点，不仅污染了水源、大气和土壤，也严重威胁人类和动物的安全。1938年，英国学者首次报道牧草中铅的含量过高，可使放牧羊产生以剧烈腹泻和被毛褪色为特征性症状的铅中毒症，称之为“Teart”病。在我国，铅和精炼铅产量居世界第三位，主要用于蓄电池制造、颜料、合金等行业。1923年开始在汽油中加入铅用作抗爆剂以后，更加速了全球性铅的污染。铅具有高蓄积性与多亲和性，可通过消化、呼吸等途径被机体吸收，对人体无任何生理功能。急性铅中毒表现为胃疼、头疼、颤抖和神经性烦燥，严重时导致昏迷，甚至死亡。慢性铅中毒大多表现为神经毒性，对血液系统、免疫系统、泌尿系统等造成一定的损害。铅是对儿童威胁最大的环境污染物之一，儿童对铅元素较成年人敏感，由于血脑屏障没有发育完整，婴幼儿的血铅水平达到100μg/L便可引起认知功能障碍或发育迟缓。鉴于铅污染和危害性较大，我国制定了土壤、食品、水体、玩具等涉铅领域的国家标准。农产品质量安全要求无公害水产品(GB18406，4-2001)对铅含量限定在≦0.5mg/kg，地下水质量标准(GB/T14848-93)中规定，集中式生活饮用水水源及工农业用水的铅离子限量为≦0.5mg/L，熟肉制品(GB2725-2005)中要求铅含量≦0.5mg/kg。目前动物性食品及环境水样中Pb2+污染的主要检测方法包括传统的理化检验和免疫学检验两种类型的方法。理化检验包括紫外分光光度法(UV)、电化学分析法、原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、氢化物发生-原子荧光光谱法(HG-AFS)和中子活化分析法(NAA)等，它们是目前Pb2+污染检测的主要方法，灵敏度高，结果准确，但由于需要昂贵的仪器设备、熟练的专业人员、烦琐费时、周期长、费用高、不能现场操作、样品筛检量小等缺陷，其应用受到了限制。免疫学检验方法是以抗原抗体分子的特异性、可逆性反应为基础的分析技术，包括荧光偏振免疫测定法(FPIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)KinExA免疫测定法(KIA)、胶体金免疫层析试验测定法(GICA)和微悬臂梁免疫传感器(MIS)等，由于抗原抗体的结合具有高度的选择性和敏感性，这一技术具有简便、快速、敏感、特异、经济、筛检量大等优势，代表着重金属离子检测的发展方向。目前，国内外重金属铅离子污染免疫检测技术研究非常活跃，其中公告号为CN103472230B的专利公开了一种检测铅离子的间接竞争酶联免疫试剂盒及其制备方法，其检测灵敏度为10.31ng/mL，并且检测时间较长。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于直接竞争酶联免疫法检测铅离子试剂盒及其应用，使所述试剂盒具有检测时间短的优点，同时具有灵敏度高、特异性强的特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种基于直接竞争酶联免疫法铅离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；(2)质量浓度为20～50μg/mL的酶标Pb-ITCBE鳌合物半抗原溶液；(3)质量浓度为10～20μg/mL的抗铅离子单克隆抗体溶液；所述抗铅离子单克隆抗体溶液由Pb-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；(4)1.0～3.0mol/L的终止液；(5)样品稀释液；(6)底物显色液；(7)洗涤液；(8)铅离子标准品溶液；(9)质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。优选的，所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为80～150μg/mL。优选的，所述酶标Pb-ITCBE鳌合物半抗原的质量浓度为30～40μg/mL。优选的，所述抗铅离子单克隆抗体溶液的质量浓度为13～18μg/mL。优选的，所述样品稀释液为质量浓度为2～10g/L的HEPES缓冲液。优选的，所述洗涤液为包含质量浓度0.05～0.1％Tween20的PBS溶液。本专利技术还提供了所述铅离子检测试剂盒在检测环境中铅离子的应用，包括以下步骤：a、将抗铅离子单克隆抗体溶液、稀释的待测样品溶液和酶标Pb-ITCBE鳌合物半抗原溶液，加入到包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板孔内，混合，孵育后用洗涤液洗涤；b、向检测板中加入底物显色液，孵育，加入终止液混合，测定OD值；c、根据所述步骤b得到的OD值与预定的标准曲线，得到待测样品中铅离子的浓度，所述标准曲线是铅离子浓度与OD值之间的线性关系曲线。优选的，所述检测板孔内抗铅离子单克隆抗体溶液、稀释的待测样品溶液和酶标Pb-ITCBE鳌合物半抗原溶液的体积比为1～2：1～2：1～2。优选的，所述步骤a和b中孵育的温度独立地为30～40℃。优选的，所述步骤a和b中孵育的时间独立地为5～30min。本专利技术提供了一种基于直接竞争酶联免疫法铅离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；(2)质量浓度为20～50μg/mL的酶标Pb-ITCBE鳌合物半抗原；(3)质量浓度为10～20μg/mL的抗铅离子单克隆抗体溶液；所述抗铅离子单克隆抗体溶液由Pb-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；(4)1.0～3.0mol/L的终止液；(5)样品稀释液；(6)底物显色液；(7)洗涤液；(8)铅离子标准品溶液；(9)质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。本专利技术根据抗原抗体直接竞争性免疫层析原理设计，通过在检测板上预包被羊抗鼠IgG二抗，使抗铅离子单克隆抗体、待检样品或铅离子标准品溶液和酶标半抗原(Pb-ITCBE-HRP)三种物质能够同时加入，抗铅离子单克隆抗体与预包被羊抗鼠IgG二抗结合形成复合物，样品或标准品中的铅离子和酶标半抗原竞争性地与抗铅离子单克隆抗体结合，当加入底物显色液时，样品吸光度值与其残留的铅离子含量呈负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中铅离子的含量。本专利技术提供的试剂盒，减少了传统竞争法中两次孵育和洗涤次数，缩短了孵育和洗涤的时间30min，使试剂盒快速简便地得到检测结果，大大缩短了检测周期。本专利技术提供的铅离子检测试剂盒最低检测限(LOD)可达0.15μg/L，检测范围为0.17～36.4μg/L。附图说明图1为实施例1中免疫原合成路线图；图2为实施例8中建立的dELISA和ciELISA标准曲线。具体实施方式本专利技术提供了一种基于直接竞争酶联免疫法铅离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；(2)质量浓度为20～50μg/mL的酶标Pb-ITCBE鳌合物半抗原溶液；(3)质量浓度为10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于直接竞争酶联免疫法铅离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；(2)质量浓度为20～50μg/mL的酶标Pb‑ITCBE鳌合物半抗原溶液；(3)质量浓度为10～20μg/mL的抗铅离子单克隆抗体溶液；所述抗铅离子单克隆抗体溶液由Pb‑ITCBE‑cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；(4)1.0～3.0mol/L的终止液；(5)样品稀释液；(6)底物显色液；(7)洗涤液；(8)铅离子标准品溶液；(9)质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。

【技术特征摘要】
1.一种基于直接竞争酶联免疫法铅离子检测试剂盒，包括：(1)包被有羊抗鼠IgG二抗的检测板，所述检测板真空密封包装；所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为50～200μg/mL；(2)质量浓度为20～50μg/mL的酶标Pb-ITCBE鳌合物半抗原溶液；(3)质量浓度为10～20μg/mL的抗铅离子单克隆抗体溶液；所述抗铅离子单克隆抗体溶液由Pb-ITCBE-cBSA免疫原免疫Balb/C小鼠制备而来；(4)1.0～3.0mol/L的终止液；(5)样品稀释液；(6)底物显色液；(7)洗涤液；(8)铅离子标准品溶液；(9)质量浓度为10～20mg/mL的EDTA处理液。2.根据权利要求1所述的检测铅离子试剂盒，其特征在于，所述羊抗鼠IgG二抗的包被浓度为80～150μg/mL。3.根据权利要求1所述的检测铅离子试剂盒，其特征在于，所述酶标Pb-ITCBE鳌合物半抗原溶液的质量浓度为30～40μg/mL。4.根据权利要求1所述的检测铅离子试剂盒，其特征在于，所述抗铅离子单克隆抗体溶液的质量浓度为13～18μg/mL。5.根据权利要求1所述的检测铅离子试剂盒，其特征在于，所述样...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜金庆，刘长忠，张慧辉，王自良，杨雪峰，李广领，齐永华，范国英，张海棠，李艺，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南,41