本发明专利技术为金刚烷胺酶联免疫吸附检测专用测试盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简单、且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测，为此本发明专利技术还提供了专用测试盒的制备及检测方法。其包括浓缩洗涤液、浓缩复溶液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于：包被有金刚烷胺固相抗原的包被板、金刚烷胺标准品、金刚烷胺抗体冻干品。检测时，取包被板，加入50μL抗金刚烷胺抗体，25℃左右孵育0.5h，洗涤液洗3～5次，加100μL辣根过氧化物酶（HRP）—羊抗鼠抗体，25℃左右孵育0.5h，用洗涤液洗3～5次，加50μL显色液A和50μL显色液B，避光静置10分钟～20分钟后加终止液50μL，在450nm处测吸光度值，根据标准曲线计算样品中金刚烷胺的含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物及食品安全检测领域，具体为金刚烷胺酶联免疫吸附检测专用测试盒及制备及检测方法。
技术介绍
金刚烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒药，羞星于亚洲感冒流行的1966年批准其作为预防药。并于1976年在预防药的基础上确认其为治疗药。该药对成年患者的疗效及安全性已得到广泛认同。但治疗剂量与产生副作用的剂量很接近，对高龄者及有慢性心肺疾病或肾脏疾病者的剂量和给药计划很难确定，因此尚未在临床上推广应用。在且灰，金刚烷胺一直作为帕金森病的治疗药，直到1998年才被批准用于流感病毒A型感染性疾病的治疗。金刚烷胺可用于亚洲甲-1I型流感的预防和早期治疗，与抗菌素合用可治败血症和病毒性肺炎，并有退烧作用。也有抗震颤麻痹的作用。适用于原发性帕金森病、脑炎后的帕金森综合征、药物诱发的锥体外系反应、一氧化碳中毒后帕金森综合征及老年人合并有脑动脉硬化的帕金森综合征。根据其药理作用，国内现在主要将金刚烷胺用于鸡、猪流感的预防和早期治疗，及猪传染性胃肠炎的防治。为避免影响国家动物疫病强制性免疫政策落实，给重大动物疫病防控工作带来不良后果，农业部发布《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，规定除经批准生产、使用的疫苗产品外，禁止使用金刚烷胺防治高致病性禽流感等一类病原微生物引起的病毒性疫病。2005年农业部《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，已将金刚烷胺、金刚乙胺等列入《兽药地方标准废止目录》，明确要求立即停止生产、经营和使用，违者按生产、经营假兽药和使用禁用兽药处理。2005年中国政府《农业部公告(第560号)》也明确指出，“金刚烷胺类等人用抗病毒药移植兽用，缺乏科学规范、安全有效实验数据，用于动物病毒性疫病不但给动物疫病控制带来不良后果，而且影响国家动物疫病防控政策的实施。” 2012年11月底被爆出养殖的一只鸡从孵出到端上餐桌，只需要45天，是用饲料和药物喂养的。其中一些不法商贩采用金刚烷胺人用药物，用于抑制禽类的禽流感等病症。其原因是价格低廉，但如果用量不当会导致其在禽类体内残留或禽流感病毒变异，人体食用后会对人体造成伤害。我国对于动物源性食品中金刚烷胺残留含量的相关研究报道属于空白，也未曾制定或立项过国家标准、行业标准，国际上也无特定限量要求及相应检测方法。研究食品中金刚烷胺残留含量的检测技术，对于指导进出口食品中金刚烷胺含量控制，有效应对日本肯定列表制度，及时消除潜在的出口贸易障碍，促进相关行业拓展国际市场，具有紧迫的现实意义。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了金刚烷胺酶联免疫吸附检测专用测试盒，其检测快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特异性强，简化了样品预处理和纯化过程，特别适用于大批量样品的检测，为此本专利技术还提供了专用测试盒的制备及检测方法。金刚烷胺酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括浓缩洗涤液、浓缩复溶液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于:其还包括包被有金刚烷胺固相抗原的包被板、金刚烷胺标准品、金刚烧胺抗体冻干品。金刚烷胺的酶联免疫吸附检测专用测试盒的制备，其特征在于:其包括以下步骤，包被板的制备、金刚烷胺标准品的制备、金刚烷胺一卵清蛋白(0VA)偶联物的制备，抗金刚烷胺抗体及其溶液的制备，完全福氏佐剂的制备，不完全福氏佐剂的制备、酶标记的羊抗鼠抗体冻干品的制备；显色液A的制备:显色液B的制备；终止液的制备。其进一步特征在于:所述包被板包被金刚烷胺固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用pH9~10 Na2C03—NaHC03的缓冲液作为包被液，将金刚烷胺一卵清蛋白(0VA)稀释至0.1 μ g/mL~l.0 μ g/mL, 96或48或24孔微孔板各加100 μ L, 2~8°C放置过夜或放37°C烘箱中孵育2 h,弃去包被液，洗涤2~3次，加入含1%~5%牛血清蛋白(溶于pH 7?8的磷酸盐缓冲液)，2~8°C封闭过夜或37°C烘箱中放置1.5 h，弃去封闭液，吹干，板条密封后置2-8 °C保存。所述金刚烷胺标准品用10%甲醇溶液稀释，浓度为:1 ng/mL~81ng/mL。金刚烷胺一牛血清白蛋白(BSA)偶联物的制备:将金刚烷胺溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1 一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌120分钟~180分钟；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于5mL甲醇中，超声波处理30分钟后，6000 rpm—15000 rpm下离心30分钟，取上清液；将沉淀物用甲醇溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温震荡60 min,离心；将上清液缓慢滴加到牛血清白蛋白(溶于0.01 M-0.2 M NaHC03溶液中)，在2~8°C震荡2h~3h，然后，在0.01 M-0.2 Μ磷酸盐缓冲液(PBS溶液)(ρΗ7~8)中透析，换透析液3~8次；冷冻干燥，偶联物2_8°C保存。金刚烷胺一卵清蛋白(0VA)偶联物的制备:将金刚烷胺溶解在吡啶中，在反应瓶中加入1 一丁基硼酸；混合物在室温下搅拌过夜；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮气；密封反应瓶，混合物在沸水浴中搅拌120分钟~180分钟；将吡啶在室温吹干后，加入少量的水，然后将残余物溶解于5 mL甲醇中，超声波处理30分钟后，6000 rpm—15000 rpm下离心30分钟，取上清液；将沉淀物用甲醇溶解，重复上述操作，合并上清液，将上清液减压浓缩后备用；取浓缩物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳化二亚胺(DCC)溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，室温震荡60 min,离心；将上清液缓慢滴加到卵清蛋白(溶于0.01M-0.2 MNaH C03溶液中)，在2~8°C震荡2 h~3 h,然后，在0.01 Μ — 0.2 Μ磷酸盐缓冲液(PBS溶液)(ρΗ7~8)中透析，换透析液3~8次；冷冻干燥，偶联物2_8°C保存。抗金刚烷胺抗体及其溶液的制备:取金刚烷胺一牛血清白蛋白偶联物用生理盐水配成0.1 μ g/mL~10 μ g/mL抗原溶液与等体积完全福氏佐剂混勻，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为50 "100 μ g/只小鼠，以后每隔2周到4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量为50 "100 μ g/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP-2/o以10:1比列混合，离心，去除上清，在50 s~90 s内将0.1 mL~10 mL50%聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其溶解，1~3 min后加入10 mL~50 mLDMEM培养液，终止融合，水浴静置10 mirT30min后离心，去除上清；将融合细胞用含5%~30%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为IX 104~1X 106饲养细胞/0.lmL接种于以小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5%~10%C02，35本文档来自技高网...
【技术保护点】
金刚烷胺酶联免疫吸附检测专用测试盒，其包括浓缩洗涤液、浓缩复溶液、显色液A、显色液B和终止液，其特征在于：包被有金刚烷胺固相抗原的包被板、金刚烷胺标准品、金刚烷胺抗体冻干品以及酶标记的羊抗鼠抗体冻干品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜道林，邢海龙，洪霞，
申请(专利权)人：江苏维赛科技生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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