一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法技术

一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，涉及葡聚糖。1)酶标反应板的包被；2)酶标反应板的封闭；3)加检测样品；4)加酶标二抗；5)加底物显色；6)终止反应；7)OD值的测定。杂交瘤细胞株D9保藏编号为CCTCC NO：C2010107。基于抗葡聚糖单克隆抗体建立的夹心酶联免疫吸附测定方法，可定量检测样本中的葡聚糖，具有特异性强、灵敏度高、快速简便易于操作、对仪器的要求低等优点，更能适应大规模样品检测的需要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及葡聚糖，特别是涉及。
技术介绍
葡聚糖，又名右旋糖酐，由数个葡萄糖分子聚合而成，具有较高的分子量，葡萄糖 残基之间主要以α-1，6键连接，支链主要有1，2键，1，3键，1，4键等。葡聚糖可由蔗糖溶 液中污染的细菌的葡聚糖蔗糖酶催化下产生：蔗糖一葡聚糖+果糖。葡聚糖从结构上可以 分为α型和β型：前者常见于细菌分解蔗糖产生，后者具有生理活性，存在于真菌细胞壁 中。（1.范瑞梅，范家恒.葡聚糖的免疫作用及研究进展.甘蔗糖业，2006,（6) :38-41) 近年来，由于葡聚糖在医学和食品工业上的应用不断增多，有关葡聚糖的检测也 引起了人们的关注，针对葡聚糖含量的检测在方法上有了很大的发展，已经建立起了多种 检测方法，但是由于免疫学方法自身的诸多优点，使其很快在葡聚糖的检测上得到了重视。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供具有特异性强、灵敏度高、快速简便、易于操作、对仪器的要 求低等优点，可用于对不同样品中的葡聚糖进行定量检测的一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸 附测定方法。 本专利技术包括以下步骤： 1)酶标反应板的包被，具体方法为：取葡聚糖单克隆抗体杂交瘤细胞株D9包被96 孔酶标板，100 μ L/孔，同时设置阴性对照孔和空白孔，4°C过夜； 2)酶标反应板的封闭，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加封闭液，37°C 孵育； 3)加检测样品，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入Dextran 2000标准 品或样品溶液，100 μ L/孔，同时设标准品零值孔、阴性孔，每个样品设3个复孔，37°C反应； 4)加酶标二抗，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入D24酶标抗体，37°C 温育； 5)加底物显色，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入显色(PD溶液，37°C 温育； 6)终止反应，具体方法为：每孔加入50 μ L氏304溶液终止反应； 7)0D值的测定，具体方法为：用酶标仪测定，以空白孔调零，在Α490波长测定样品 和阴性对照的OD值，完成葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定。 在步骤1)中，所述葡聚糖的质量浓度可为2. 5 μ g/mL，所述杂交瘤细胞株D9已 于2010年12月07日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编： 430072,保藏中心保藏编号为CCTCC NO :C2010107 ;所述包被的包被液可采用摩尔浓度为 0· lmol/L的碳酸盐缓冲液，pH 9. 6〇 在步骤2)中，所述洗涤剂可采用pH 7. 2的PBST，所述洗涤的次数可为5次，每次 洗涤的时间可为90s ;所述封闭液可采用IOmM的PBS溶液，含2% BSA ;所述封闭液的加入 量可为每孔加封闭液200 μ L ;所述孵育的时间可为2h。 在步骤3)中，所述洗涤剂可采用PBST，所述洗涤的次数可为5次，每次洗涤的时间 可为90s ;所述反应的时间可为lh。 在步骤4)中，所述洗涤剂可采用PBST，所述洗涤的次数可为5次，每次洗涤的时间 可为90s ;所述D24酶标抗体可采用1 : 8000的D24酶标抗体，1 : 8000的D24酶标抗体 可通过改良的高碘酸氧化法制备；加入D24酶标抗体的量可为100 μ L/孔；所述温育的时 间可为45min。 在步骤5)中，所述洗涤剂可采用PBST，所述洗涤的次数可为5次，每次洗涤的时间 可为90s ;所述加入显色(PD溶液的量可为50 μ L/孔；所述温育的时间可为lOmin。 在步骤6)中，所述H2SO4溶液的摩尔浓度可为2mol/L。 本专利技术基于抗葡聚糖单克隆抗体建立的夹心酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法，可定量检测样本中的葡聚糖，具有特异性强、灵敏度 高、快速简便易于操作、对仪器的要求低等优点，更能适应大规模样品检测的需要。【附图说明】 图1为抗体纯化SDS-PAGE电泳鉴定。 图2为酶标抗体效价测定。 图3为不同株抗体ELISA实验。 图4为抗体与酶标抗体棋盘滴定实验。 图5为ELISA标准曲线及线性范围。 图6为抗体稳定性比较。 图7为抗体特异性鉴定。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施 例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。 实施例1 :葡聚糖双抗体夹心ELISA检测方法的建立 1、材料 I. 1抗葡聚糖单克隆抗体 抗葡聚糖单克隆抗体D9为高效的杂交瘤细胞分泌的，制备方法见第2. 2节。 1. 2主要试剂及仪器 Dextran 标准品 Pharmacia 公司；rProtein A 填料 Sepharose?;辣根过氧化物酶 (HRP)购自Sigma公司；BSA，OVA购自Sigma公司；OPD购自Sigma公司，高碘酸钠购自上海 生工；硼氢化钠购自上海生工；包被板条购自JET公司；BSA购自Sigma公司；其它常规化学 试剂均为国产分析纯试剂。 2、方法 2. 1葡聚糖检测试剂标准品配制 称取 Ig Dextran 2000,用磷酸盐缓冲液（ρΗ7· 2,0· 01mol/L PBS)稀释到 1000mL， 得到浓度为1000 μ g/mL的母液，再按实验要求用PBS将母液稀释得到各种浓度。 2. 2抗体的制备与纯化鉴定 采用腹水法制备抗体。石蜡油注射到小鼠腹腔，0. 5mL/只，1~2周后每只小鼠腹 腔注射2 X IO6个杂交瘤细胞，注射细胞10~15d后，收集小鼠腹水，3000r/min离心10min， 弃油脂，收集中间澄清腹水，备用。采用亲和层析法纯化抗体，依照rProtein A试剂说明书 进行纯化，Lowry法检测抗体蛋白浓度，SDS-PAGE电泳鉴定抗体的纯度，间接ELISA测定抗 体效价。选择效价最高的抗体进行酶标。 2. 3抗体的酶标与效价测定 采用高碘酸氧化法标酶，步骤如下： (1)称取5mg HRP溶解于ImL蒸馏水中； (2)加入0· 2mL新配的0· IM NaIO4溶液，室温下避光搅拌20min ; (3)将上述溶液装入透析袋中，对ImM ρΗ4· 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜； (4)加0· 2M ρΗ9· 6碳酸盐缓冲液，使醛化的HRP的pH升高到9. 0~9. 6,然后立 即加入IOmg葡聚糖抗体，室温避光轻轻搅拌2h ; (5)加 0· ImL 新配的 4mg/mL 似8!14液，混匀，置 4°C 2h ; (6)将上述液装入透析袋中，对0· 15M ρΗ7· 4PBS透析，4°C过夜； (7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C Ih ; (8) 3000rpm离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于 少量 0· 15M ρΗ7· 4 的 PBS 中； (9)将上述溶液装入透析袋中，对0· 15Μ ρΗ7· 4的PBS缓冲液透析，换液4~6次， 10, OOOrpm离心30min取上清液，加等量甘油，分装，-20°c本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定方法，其特征在于包括以下步骤：1)酶标反应板的包被，具体方法为：取葡聚糖单克隆抗体杂交瘤细胞株D9包被96孔酶标板，100μL/孔，同时设置阴性对照孔和空白孔，4℃过夜；2)酶标反应板的封闭，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加封闭液，37℃孵育；3)加检测样品，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入Dextran 2000标准品或样品溶液，100μL/孔，同时设标准品零值孔、阴性孔，每个样品设3个复孔，37℃反应；4)加酶标二抗，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入D24酶标抗体，37℃温育；5)加底物显色，具体方法为：用洗涤液洗涤酶标板，拍干，加入显色OPD溶液，37℃温育；6)终止反应，具体方法为：每孔加入50μL H2SO4溶液终止反应；7)OD值的测定，具体方法为：用酶标仪测定，以空白孔调零，在A490波长测定样品和阴性对照的OD值，完成葡聚糖的夹心酶联免疫吸附测定。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：颜江华，王生育，罗芳洪，吴婷，王勇军，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35