一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法，该试剂盒包含神经元特异性烯醇化酶标准品、反应缓冲液、清洗液、脂质体复合物、磁性分离试剂。所述的脂质体复合物为内部包裹有联吡啶钌Ru(bpy)

Rapid diagnosis neuron specific enolase kit and its using method

The invention relates to a rapid diagnosis of neuron specific enolase kit and use method thereof, the kit contains neuron specific enolase standard, reaction buffer, cleaning liquid, liposome complexes, magnetic separation reagent. The liposome complex is internally encapsulated with bipyridine ruthenium Ru (bpy)

【技术实现步骤摘要】
一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法
本专利技术属于医学生物类免疫检测试剂领域，具体涉及一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法。
技术介绍
神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase，NSE)是一种肝糖分解酶，特异性存在于神经元、周围神经组织和神经内分泌组织内，其他脏器及脑脊液中的分布水平不及中枢神经系统的1％。当神经元或神经内分泌细胞发生缺血、缺氧、中毒或损伤时，细胞膜的完整性受到破坏，NSE从损伤的细胞内“漏出”，最先进入脑脊液中，通过破坏的血脑脊液屏障进入血液循环，导致NSE在外周血和脑脊液中的浓度明显升高，因此NSE是中枢神经系统损害的标志物，通过检测血清或脑脊液中NSE的变化，为证实颅脑损伤的发生、判断颅脑损伤的程度、预测患者的预后提供了依据。此外，NSE在小细胞肺癌和神经母细胞瘤等内分泌肿瘤中显示出很高的免疫活性，许多研究者相继证明，NSE用于小细胞肺癌诊断，是一个具有高特异性和高灵敏性的肿瘤标记物，其特异性高达80～90％，诊断灵敏度达80％；当应用NSE作神经母细胞瘤鉴别诊断时，其阳性率可达96～100％。因此，通过检测血清中的NSE，对于小细胞肺癌和神经母细胞瘤的检测疗效和预报复发均具有重要的参考价值。监测患者血清中NSE含量的动态变化还可作为预测癌细胞是否有脑转移趋势的一个重要指标。因此，NSE是监测神经系统疾病和肿瘤的重要标志物，提供一种能准确、快速检测NSE的方法满足临床诊断和科研的需要，具有重要意义。我国目前获准上市的NSE国产和进口检测试剂盒约7个品种，检测原理主要有酶联免疫法(ELISA)、化学发光免疫法(CLIA)、电化学发光免疫法(ECLI)和时间分辨免疫荧光法(TRFIA)等。其中，传统的酶联免疫分析自动化程度不高，操作过程繁琐，受人为操作因素影响很大，不利于高通量的全自动检测，特异性和灵敏性有待提高，已逐渐被其他三种检测手段取代。新兴的化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析和时间分辨免疫荧光分析具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、操作简便、容易实现自动化的优点，是理想的临床微量生化检验的分析手段。但目前，具有自主知识产权的国产NSE检测试剂盒较少，且大部分均基于酶联免疫分析而设计的，涉及上述三种新兴检测手段的试剂盒更为少见，均依靠国外进口，价格昂贵，给患者带来很大经济负担，不利于基层普及。基于此，国内本领域的学者致力于NSE试剂盒的研发，如崔晓丙等人在“神经元特异性烯醇化酶(NSE)时间分辨免疫荧光免疫分析试剂盒的临床性能评价”(现代医学仪器与应用，2008,20(1),4-7)中披露采用自制的时间分辨免疫荧光免疫分析试剂盒检测血清中的NSE，与进口Roche电化学发光试剂盒检测比较，两者测定值接近，相关系数为0.973，达到国外进口的水平。又如贺安等人在“神经元特异性烯醇化酶光激化学发光免疫分析法的建立”(现代免疫学，2011,31(1),44-47)中披露采用自制的光激化学发光免疫分析快速检测试剂盒检测血清中的NSE，与进口Roche电化学发光试剂盒检测比较，两者测定值接近，相关系数为0.979，达到国外进口的水平。除了上述所述的几种检测手段外，国内学者也尝试将不同的技术手段结合，开发出使用更为简便，具有更高检测灵敏度和特异性地试剂盒，如公开号为CN102914650B的中国专利申请“神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒及其制备方法与应用”以免疫磁珠微粒与化学发光技术相结合，可实现样本和试剂一次加入，大大简化了检测程序，缩短检测时间，并达到较佳的性能参数。又如公开号为CN103175964B的中国专利申请“神经元特异性烯醇化酶定量检测试剂盒及其制备方法”以化学交联法将NSE单克隆体和多克隆抗体复合包被粒径为80-240nm的胶乳颗粒，保证检测试剂盒具有高灵敏度及较宽的检测线性范围，且操作简便、快速、特异性强、稳定性好。电化学发光免疫法(ECLI)检测是在化学发光和电化学基础上发展而来的一种分析方法，其通过在电极上施加一定电压以引发电化学反应，电化学反应释放的能量再激发发光体，当激发态发光体返回基态时便产生光发射，从而可以根据光发射强度来实现对待测物的分析。目前基于电化学发光免疫分析原理的检测仪器已成功商品化，如罗氏诊断公司(RocheDiagnostics)的Roche型电化学发光免疫分析仪及其配套试剂盒，采用钌联吡啶衍生物作为标记探针，磁珠为反应载体，并结合自动化的试剂传输系统，可快速检测多种疾病标志物。但基于电化学发光免疫技术用于检测NSE的国产试剂盒的研究相对较少，不能满足国内需求。
技术实现思路
为解决现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒，采用该试剂盒进行NSE检测具有较高的灵敏度和特异性，且操作简单，操作流程短。本专利技术另外一个目的在于提供一种所述快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒的使用方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其包含神经元特异性烯醇化酶标准品、反应缓冲液、清洗液、脂质体复合物、磁性分离试剂。所述的脂质体复合物为内部包裹有联吡啶钌Ru(bpy)32+和纳米金粒子复合物，表面包被有抗神经元特异性烯醇化酶抗体，所述的纳米金粒子为粒径在2～50nm的类球形纳米金。所述的磁性分离试剂由生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体和链霉亲和素包被的磁性微粒制备而成。本专利技术提供的试剂盒为夹心法电化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法，基本原理为：利用脂质体将发光物质(Ru(bpy)32+和纳米金粒子复合物)进行包裹，并进行脂质体表面抗体化结合，制备脂质体复合物；利用生物素与链霉亲和素的相互作用，将生物素化的抗体与链霉亲和素包被的磁性微粒进行络和，制备磁性分离试剂；将脂质体复合物、待测物质(抗原)、磁性分离试剂混合，在室温下充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物的“三明治”结构，在外磁场的作用下，磁性微粒-抗原-脂质体复合物吸附于电极表面，加入反应缓冲液，使脂质体复合物释放出发光物质，所述的发光物质再次吸附于电极表面，开启电压后，发光底物及反应参与物在电极表面失去电子而被氧化。电子供体失去一个H+而成为强还原剂，将发光底物还原为激发态，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒中，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：(1)按质量比为(4～10):1的比例分别取Ru(bpy)32+和纳米金粒子，利用静电吸附作用，将带正电荷的Ru(bpy)32+吸附于带负电荷的纳米金粒子上，制得Ru(bpy)32+和纳米金粒子复合物；(2)将Ru(bpy)32+和纳米金粒子复合物溶于Tris缓冲溶液中，制成质量浓度为2％的溶液，所述的Tris-HCl缓冲溶液含有10mM三羟甲基氨基甲烷和15mM氯化钠，pH为7.2；(3)取二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含神经元特异性烯醇化酶标准品、反应缓冲液、清洗液、脂质体复合物、磁性分离试剂。

【技术特征摘要】
1.一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含神经元特异性烯醇化酶标准品、反应缓冲液、清洗液、脂质体复合物、磁性分离试剂。2.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的脂质体复合物为内部包裹有联吡啶钌Ru(bpy)32+和纳米金粒子复合物，表面包被有抗神经元特异性烯醇化酶抗体，所述的纳米金粒子为粒径在2～50nm的类球形纳米金。3.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的磁性分离试剂由生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体和链霉亲和素包被的磁性微粒制备而成。4.根据权利要求1或2所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：(1)按质量比为(4～10):1的比例分别取Ru(bpy)32+和纳米金粒子，利用静电吸附作用，将带正电荷的Ru(bpy)32+吸附于带负电荷的纳米金粒子上，制得Ru(bpy)32+和纳米金粒子复合物；(2)将Ru(bpy)32+和纳米金粒子复合物溶于Tris缓冲溶液中，制成质量浓度为2％的溶液，所述的Tris-HCl缓冲溶液含有10mM三羟甲基氨基甲烷和15mM氯化钠，pH为7.2；(3)取二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，静置30min，然后加入1mLRu(bpy)32+和纳米金粒子复合物溶液，在60℃水浴中振荡反应约1h，得脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液超声处理3min，然后使用注射器式滤器调整脂质体的粒径至90～100nm，得到内部包裹有Ru(bpy)32+和纳米金粒子复合物的脂质体；(4)取1mL内部包裹有Ru(bpy)32+和纳米金粒子复合物的脂质体与1mL质量浓度为2％的1,5-戊二醛溶液混合，室温下反应2h，然后用10mMpH7.2的PBS溶液进行透析12～24h，以除去多余的1,5-戊二醛，然后在4℃下，加入抗神经元特异性烯醇化酶抗体，所述抗体在体系中的终浓度为10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，继续孵育12h，以阻断脂质体表面上的非特异性位点，将得到的脂质体复合物置于4℃保存，即得；其中，所述步骤(3)中二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的摩尔比为20:10:4。5.根据权利要求3所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征在于，所述的生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体的制备包括以下步骤：取抗神经元特异性烯醇化酶抗体溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为1.0～2.0mg/mL的溶液；另取EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为10～50mM的溶液；然后取1mL浓度为1.0～2.0mg/mL的抗神经元特异性烯醇化酶抗体溶液与25μL的浓度为10～50mM的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室温中反应1～2h，再使用PD-10的凝胶过滤器进行过滤，即得生物素化合的抗神经元特异性烯醇化酶抗体。6.根据权利要求3所述的神经元特异性烯醇化酶试剂盒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立国，邹伟权，张亚丽，李庆祥，母润红，王涛，苏焱，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44