一种新的增强型抗原联合多肽诱导肝癌特异性CTL细胞的制备及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新的增强型GPC3‑AFP‑NY‑ESO‑1联合多肽诱导肝癌特异性CTL细胞的制备及应用。本发明专利技术选择从GPC3、AFP、NY‑ESO‑1中筛选出的新的肝癌细胞表面抗原多肽进行顺序片段连接。将新筛选出的GPC3、AFP、NY‑ESO‑1多肽顺序连接为CTL抗原表位肽SEQ ID NO:4。本发明专利技术建立了一种针对肝癌细胞进行高效特异性肿瘤杀伤的新方法和手段，得到的肝癌特异性杀伤CTL细胞克服了针对肿瘤杀伤效率低下，培养时间过长等关键问题，能够特异性增强肝癌免疫治疗的效果，具有肿瘤治疗应用前景。

Preparation and application of a new type of enhanced antigen combined polypeptide inducing hepatoma specific CTL cells

The present invention provides a new enhanced preparation and application of GPC3 AFP NY ESO 1 peptide induced hepatoma specific CTL cells. The invention of the order from GPC3, AFP, cloned NY ESO 1 screened new cell surface antigen peptide. The newly identified GPC3, AFP, NY ESO 1 polypeptide sequence connection for CTL epitope peptide SEQ ID NO:4. The invention provides a new method and means of efficient tumor specific killing in hepatoma cells, the hepatoma specific killer CTL cells to overcome the tumor killing efficiency is low, the key problems of training time is too long, can enhance the specific immunotherapy of hepatocellular carcinoma with tumor treatment effect, application prospect.

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于免疫细胞制备领域，具体涉及一种新的增强型GPC3-AFP-NY-ESO-1联合多肽诱导肝癌特异性CTL细胞的制备方法及应用。
技术介绍
：我国是全球原发性肝细胞癌(PrimaryHepatocellularCarcinoma)高发国家，全球每年新发肝癌约100万人，我国占55％。2015年我国癌症登记网统计显示，在60岁之前的男性人群中，肝癌的死亡占比最高。近年来，尽管在治疗上已经有了一些突破，例如外科手术、介入治疗以及移植，但是肝癌的快速进展、转移性等仍然是需要克服的关键问题。肿瘤免疫治疗目前已成为治疗和消除肿瘤的重要手段和方法，其也将成为今后治疗肿瘤的重要方向。体内的免疫系统主要包括固有免疫和适应性免疫系统，固有免疫和适应性免疫发挥作用的方式和手段各有不同，它们都在抵抗肿瘤的侵袭中发挥不可或缺的作用。在肿瘤治疗过程中，现在过继免疫细胞治疗已经被广泛采纳，过继免疫细胞治疗主要通过体外诱导与活化机体固有的生物调节系统来刺激具有细胞毒性和杀伤能力的细胞和细胞因子产生，增强机体杀伤肿瘤的特异性细胞的分化能力，在细胞水平上杀伤肿瘤细胞，同时有效地抑制肿瘤细胞的复发和转移，并提高肿瘤患者的自体免疫功能。现在临床上应用较多是针对肿瘤靶点的特异性抗体，抗体在体内的半衰期较短，需要间隔重复给药，治疗成本昂贵并且存在较多的副反应。免疫细胞治疗的方法克服了传统治疗的缺点，随着在细胞水平和分子水平上对肿瘤免疫的认识发展深入，负载肿瘤抗原的树突状细胞(DendriticCells,DC)来致敏自体淋巴细胞，从而获得针对肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTLymphocyte,CTL)的方法，已经成为了免疫治疗的重要手段和方法。通过这种方法获得的特异性CTL，可以在体外或者体内大量扩增，并且具有免疫记忆性，特异性识别肿瘤表面抗原，杀伤肿瘤细胞。CTL需要特异性肿瘤抗原以及抗原呈递细胞(Antigen-presentingcell,APC)提供的共刺激信号共同激活，针对肿瘤相关特异性抗原的筛选成为了近些年研究的重点，如何筛选出免疫原性强、特异性高的肿瘤相关抗原(Tumor-associatedantigen,TAA)肿瘤特异性抗原(Tumorspecificantigen,TSA)成为了肿瘤治疗研究工作者需要解决的重要问题。针对TAA或TSA的多肽免疫治疗性疫苗，安全、易于制备保存、特异性高，能有效地杀伤肿瘤细胞，成为了现在应用较为广泛的治疗方法。细胞毒性T淋巴细胞的激活需要APC发挥呈递抗原的作用，APC可以将肿瘤相关抗原降解为多肽并且形成多肽-MHC复合物后呈递给T细胞受体(TCellReceptor,TCR)进行识别，从而激活细胞毒性T淋巴细胞，产生细胞毒性反应。多肽疫苗是用高剂量及广谱的肿瘤抗原多肽给予APC，使其和MHC分子相结合，能有效并且广谱地呈递给细胞毒性T细胞。由于肿瘤抗原多肽受到MHC分子的限制性、多肽疫苗的免疫原性较弱等特性，且我国HLA-A2人群比例较高，在肝癌患者中比例更高，因此我们采用新的增强型HLA-A2类多肽抗原结合强抗原提呈功能DC，可以有效地提高免疫原性，诱导功能更强、种类更多的杀伤性细胞毒性T淋巴细胞。
技术实现思路
本专利技术提供了一种新的增强型GPC3-AFP-NY-ESO-1联合多肽诱导肝癌特异性CTL细胞的制备方法及应用。本专利技术提供了一种新的诱导肝癌特异性CTL细胞的增强型的联合抗原多肽，根据GPC3、AFP、NY-ESO-1的肝癌特异性表达及功能差异，经过氨基酸序列评分及功能实验，筛选出新的未公开的三种与HLA-A*0201阳性肝癌细胞匹配并且可以发挥特异性刺激效果的肝癌细胞表面抗原肽序列，并制作成联合多肽抗肝癌疫苗，这种新的联合多肽疫苗相比于传统肝癌疫苗具有明显的优势，其可克服肿瘤细胞表面抗原表达的多样性，不均一性等难点。本专利技术还提供了一种诱导新的增强型肝癌特异性CTL细胞的制备方法及其在肝癌治疗中的应用。本专利技术选择从GPC3、AFP、NY-ESO-1中筛选出的新的肝癌细胞表面抗原多肽进行顺序片段连接。将新筛选出的GPC3、AFP、NY-ESO-1(其氨基酸序列分别是：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3)多肽顺序连接为CTL抗原表位肽SEQIDNO:4。采用上述方式制备的新的多肽具有诱导针对肝癌抗原表位的杀伤及免疫增强作用，这种对肝癌细胞表面联合的新多价疫苗比使用传统抗原肽刺激具有更强的杀伤肿瘤作用。本专利技术通过以下技术方案得以实现：一种新的增强型肝癌细胞特异性联合多肽，其氨基酸序列是新筛选出的GPC3、AFP、NY-ESO-1多肽序列的组合。所述多肽组成中GPC3多肽氨基酸序列是SEQIDNO：1所示，AFP多肽氨基酸序列是SEQIDNO：2所示，NY-ESO-1多肽氨基酸序列是SEQIDNO：3所示。进一步的，所述增强型肝癌细胞特异性联合多肽，氨基酸序列是SEQIDNO：4所示。进一步的，本专利技术提供了所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽在制备肝癌细胞特异性CTL诱导剂组合物中的用途。本专利技术同时提供了所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽制备具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞的方法，所述方法包含如下步骤：1)分离HLA-A*0201阳性肝癌患者的外周血单个核细胞PBMC，收集贴壁细胞，经rhGM-CSF与rhIL-4诱导培养，获得非成熟树突状细胞；2)使用rhIL-2、rhIL-33和rhTNF-α继续诱导培养步骤1)中获得的非成熟树突状细胞，获得成熟树突状细胞；3)向步骤2)中获得的成熟树突状细胞中加入SEQIDNO：4多肽，继续培养培养，获得致敏性的成熟树突状细胞；4)将步骤3)获得的致敏性的成熟树突状细胞与原始分离的非贴壁T淋巴细胞在CTL专用培养基中共同培养，得到具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞。优选的，步骤4)中使用的CTL培养基含有浓度为100-500IU/ml的rhIL-2，2.5-15ng/ml的rhIL-7，2.5-15ng/ml的rhIL-15，2.5-15ng/ml的rhIL-21，2.5-15ng/ml的rhIL-23，0.5-5μg/ml的抗CD3抗体；更优选为使用的CTL培养基含有浓度为300-500IU/ml的rhIL-2，5-15ng/ml的rhIL-7，5-15ng/ml的rhIL-15，5-15ng/ml的rhIL-21，5-15ng/ml的rhIL-23，1-3μg/ml的抗CD3抗体；再优选含有浓度为300-400IU/ml的rhIL-2，10-15ng/ml的rhIL-7，10-15ng/ml的rhIL-15，10-15ng/ml的rhIL-21，10-15ng/ml的rhIL-23，1-2μg/ml的抗CD3抗体；最优选为含有浓度为300IU/ml的rhIL-2，10ng/ml的rhIL-7，10ng/ml的rhIL-15，10ng/ml的rhIL-21，10ng/ml的rhIL-23，1μg/ml的抗CD3抗体。本专利技术同时提供了上述制备获得的具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞在制备肝癌治疗药物中的用途。本专利技术的实施方式中，提供了联合抗原肽诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强型肝癌细胞特异性联合多肽，其特征在于，其氨基酸序列是GPC3、AFP、NY‑ESO‑1多肽序列的组合。

【技术特征摘要】
1.一种增强型肝癌细胞特异性联合多肽，其特征在于，其氨基酸序列是GPC3、AFP、NY-ESO-1多肽序列的组合。2.根据权利要求1所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽，其特征在于，该多肽组成中GPC3多肽氨基酸序列是SEQIDNO：1所示，AFP多肽氨基酸序列是SEQIDNO：2所示，NY-ESO-1多肽氨基酸序列是SEQIDNO：3所示。3.根据权利要求1或2所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽，其特征在于，氨基酸序列是SEQIDNO：4所示。4.权利要求1-3中任一所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽在制备肝癌细胞特异性CTL诱导剂组合物中的用途。5.根据权利要求1-3中任一所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽制备具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：1)分离HLA-A*0201阳性肝癌患者的外周血单个核细胞PBMC，收集贴壁细胞，经rhGM-CSF与rhIL-4诱导培养，获得非成熟树突状细胞；2)使用rhIL-2、rhIL-33和rhTNF-α继续诱导培养步骤1)中获得的树突状细胞，获得成熟树突状细胞；3)向步骤2)中获得的成熟树突状细胞中加入SEQIDNO：4多肽，继续培养，获得致敏性的成熟树突状细胞；4)将步骤3)获得的致敏性的成熟树突状细胞与原始分离的非贴壁T淋巴细胞在CTL培养基中共同培养，得到具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4)中使用的CTL培养基含...

【专利技术属性】
技术研发人员：闾军，陈辉，孙文峰，
申请(专利权)人：闾军，北京基因启明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11