与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，提供了一条与漆沟藻毒素1和4特异性结合的适配体，具有如下所示的通式：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表长度为40bp的随机序列。本发明专利技术基于氧化石墨烯SELEX技术筛选得到一条与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体。该单链DNA适配体可用于样品中痕量GTX1和GTX4的分离富集，GTX1和GTX4的分析检测，中和或拮抗漆沟藻毒素1和4药物的制备，以及水体中毒素的去除。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一条基于氧化石墨烯SELEX技术筛选获得的与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体，为样品中痕量漆沟藻毒素1和4的分离富集，漆沟藻毒素1和4的快速检测，中和或拮抗漆沟藻毒素1和4药物的制备，以及水体中毒素的去除奠定了基础。
技术介绍
麻痹性贝类中毒是三大世界性海洋生物公害之一。漆沟藻毒素1和4(Gonyautoxin1andGonyautoxin4，GTX1andGTX4)及其类似物漆沟藻毒素2和3(GTX2andGTX3)、石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)和新石房蛤毒素(neoSTX)是麻痹性贝类毒素中最具代表性的神经毒素。GTX1和GTX4可通过水中食物链在鱼类和贝类体内蓄积，人类误食这些染毒的水产品后就会引起麻痹性贝类中毒。中毒的症状主要包括四肢肌肉麻痹、头痛恶心、流涎发烧、皮疹等。中毒严重时，则会出现呼吸困难，咽喉紧张；随着肌肉麻痹不断扩展加重，最终导致死亡。麻痹性贝类毒素的毒性很强，摄入1mg就可致人死亡，对动物神经系统和心血管系统有高度特异性，使人中毒的范围在600-5000Mu之间(Mu为毒力单位，1Mu是指使18-22g的小白鼠在15min内死亡的毒力)，致死剂量为3000-30000Mu。世界各地都有包括GTX1和GTX4在内的麻痹性贝类毒素的分布，尤其是欧洲及北美一些国家。我国东南沿海一带地区也经常发生食用有毒蛤类、螺类、贝类引发的人中毒事件。由于染有GTX1和GTX4的贝类严重地危害着人类的健康和全球贝类产业的发展，因此对于海洋生物毒素GTX1和GTX4的检测显得尤为重要。长期以来，一直用于GTX1和GTX4检测的方法是国际上公认的小鼠生物学法。然而，这种方法的灵敏度低，成本高，以及需要使用大量的动物等。也有一些其他的分析方法的建立例如高效液相色谱法(HPLC)，质谱(MS)，荧光(fluorescence)及各种技术联用等,特别是液质联用技术已经被欧盟确定为首要的检测方法。但是，这些方法需要昂贵的仪器设备、专业的技术人员、检测耗时长以及毒素的标准品难以获得等问题。因此，仍迫切需要研发一种灵敏、稳定和廉价的检测系统用于海洋生物毒素GTX1和GTX4的现场快速侦测。对于一种现场快速检测方法而言，最关键的部分是分子识别探针，如常用的抗体和受体等。核酸适配体是一种具有功能的单链DNA或DNA，是通过体外筛选技术SELEX(指数富集性配体系统进化，SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)从随机核酸文库中获得的寡核苷酸序列。这些适配体序列通过分子间的作用力，例如氢键，范德华力，芳香环堆积作用力等折叠成稳定的独特的三维空间，而与靶分子高亲和力，强特异性的结合。相对于抗体而言，适配体存在许多优势，包括其稳定性高，免疫原性低，组织渗透性强，一致性好，不需要免疫动物等，故适配体作为一种新型的分析识别元件在检测，诊断和治疗方面都很有前景。近年来已有学者将适配体应用于海洋生物毒素检测领域，与生物传感器平台结合，研发了许多快速、新颖的检测方法而备受关注。然而，关于与GTX1和GTX4特异性结合的分子识别探针，与GTX1和GTX4特异性结合的高亲和力适配体，以及该适配体的亲和常数鉴定、优化及应用尚无相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一条与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体。本专利技术的第二目的在于提供通过截短的方法对该适配体进行优化得到一条特异性结合GTX1和GTX4亲和力更高的适配体(GO18-T-d)。本专利技术的再一目的是提供上述适配体在制备样品中痕量漆沟藻毒素1和4的分离富集试剂中、在制备漆沟藻毒素1和4检测试剂或试剂盒中、在制备预防或治疗漆沟藻毒素1和4中毒药物中，以及在制备去除水体中漆沟藻毒素1和4制剂中等多方面的应用。本专利技术的主要技术方案是：基于氧化石墨烯SELEX技术筛选得到一条与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体。该单链DNA适配体可用于样品中痕量GTX1和GTX4的分离富集，GTX1和GTX4的分析检测，中和或拮抗漆沟藻毒素1和4药物的制备，以及水体中毒素的去除。本专利技术的第一方面，是提供了一条与漆沟藻毒素1和4(GTX1和GTX4)特异性结合的高亲和力适配体，具有如下所示的通式：5′-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表长度为40bp的随机序列。优选的，所述单链DNA适配体选自以下序列中的任一条：GO9：如SEQIDNO：2所示；GO12：如SEQIDNO：1所示；GO17：如SEQIDNO：4所示；GO18：如SEQIDNO：5所示；GO34：如SEQIDNO：6所示；GO37：如SEQIDNO：3所示。本专利技术的第二方面在于提供以上述单链DNA适配体为基础，通过截短的方法进行优化得到一条特异性结合GTX1和GTX4亲和力更高的适配体，命名为GO18-T-d，如SEQIDNO：14所示。所述的GO18-T-d适配体，在其5’端或3’端可以进行生物素、荧光分子、同位素、电化学、酶或巯基等化学修饰。本专利技术的第三方面，是提供了上述适配体在制备样品中GTX1和GTX4(GTX1和GTX4)的分离富集试剂中的应用。本专利技术还提供了上述适配体在制备漆沟藻毒素1和4检测试剂或试剂盒中的应用。所述的试剂或试剂盒可用于快速检测水体或水产品中的GTX1和GTX4。本专利技术还提供了上述适配体在制备预防或治疗漆沟藻毒素1和4中毒药物中的应用。所述的药物也为中和漆沟藻毒素1和4的药物、或为漆沟藻毒素1和4拮抗剂等。所述的药物可以缓解、治愈漆沟藻毒素1和4中毒导致的恶心、呕吐、腹泻、神经肌肉麻痹、呼吸无力、血压下降、心率减慢、心律失常等症状。本专利技术还提供了上述适配体在制备去除水体或水产品中漆沟藻毒素1和4制剂中的应用。所述的制剂可以完全去除水体或水产品中的漆沟藻毒素1和4，或者降低水体或水产品中漆沟藻毒素1和4的含量使其达到联合国卫生组织和联合国粮农组织规定及推荐的标准以下。本专利技术鉴于GTX1和GTX4稳定性高，水溶性好的结构特点，设计了基于氧化石墨烯SELEX技术，筛选获得与GTX1和GTX4高亲和力、强特异性结合的单链DNA适配体。这些适配体作为与GTX1和GTX4特异性结合的分子识别探针，具有亲和力高、特异性强、稳定性好、免疫原性低、易制备、修饰和标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
与漆沟藻毒素1和4特异性结合的适配体，具有如下所示的通式：5′‑AGCAGCACAGAGGTCAGATG‑N40‑CCTATGCGTGCTACCGTGAA‑3′；其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表长度为40bp的随机序列。

【技术特征摘要】
1.与漆沟藻毒素1和4特异性结合的适配体，具有如下所示的通式：5′-AGCAGCACAGAGGT
CAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3′；其中，N代表碱基A，T，C，G中任一个，N40代表长度为
40bp的随机序列。
2.根据权利要求1所述的与漆沟藻毒素1和4特异性结合的适配体，其特征在于：所述适
配体选自以下序列SEQIDNO：1-SEQIDNO：6中的任一条。
3.与漆沟藻毒素1和4特异性结合的适配体，其核苷酸序列如SEQIDNO：14所示。
4.根据权利要求3所述的与漆沟藻毒素1和4特异性结合的适配体，其特征在于：所述适
配体，在其5’端或3’端进行生物素、荧光分子、同位素、电化学、酶或巯基修...

【专利技术属性】
技术研发人员：高顺祥，郑欣，胡波，刘德婧，孙铭娟，焦炳华，王梁华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31