黄曲霉毒素B1核酸适配体、DNA传感器和试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供黄曲霉毒素B1核酸适配体、DNA传感器和试剂盒及应用，该核酸适配体具有如下核苷酸序列：5’-GTTmmmmmmmTGTTGTCTCTCT GTGTCTnnnnnnnTTCGCTAGGCCCACA-3’；其中，每个m和n各自独立地为A、T、C或G且m链段和n链段互补配对。根据本发明专利技术，测定黄曲霉毒素B1无需大型仪器设备，成本低。恒温反应，能够实现肉眼的定性检测，也能够实现定量检测，并且，无需荧光染料，大大降低了成本。

Aflatoxin B1 nucleic acid aptamer, DNA sensor and kit and use thereof

The present invention provides aflatoxin B1 aptamer, DNA sensor and a kit and application, the aptamer has the following sequence: 5 \-GTTmmmmmmmTGTTGTCTCTCT GTGTCTnnnnnnnTTCGCTAGGCCCACA-3\; among them, each m and N independently of A, T, C or G and m and N segments complementary. According to the present invention, the aflatoxin B1 is not required to be used in large-scale instruments and equipment, and the cost is low. The utility model can realize the qualitative detection of the naked eye, and can realize the quantitative detection, and does not need the fluorescent dye, thereby greatly reducing the cost.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测领域，更具体地，涉及一种黄曲霉毒素B1核酸适配体，包括该核酸适配体的DNA传感器，包括该DNA传感器的试剂盒，以及该DNA传感器和试剂盒。
技术介绍
黄曲霉毒素是主要由黄曲霉、寄生曲霉产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强。目前已有的黄曲霉毒素检测方法主要有：(1)薄层层析法薄层层析是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990年它被列为AOAC(AssociationofOfficialAgriculturalChemists)标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。(2)液相色谱法液相色谱与薄层层析在许多方面具有相似性，二者互相补充。通常用TLC进行前期的条件设定，选择适宜的分离条件后再用LC进行黄曲霉毒素的定量测定。(3)免疫化学分析方法利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法也是常用的黄曲霉毒素检测方法。这类方法通常包括放射免疫分析方法，酶联免疫法和免疫层析法，它们均可以对黄曲霉毒素进行定量测定。但是这些方法成本高，并且需要使用大型昂贵的仪器，操作繁琐。核酸适配体是一段DNA(脱氧核糖核酸)，RNA(核糖核酸)或者是XNA(核酸类似物)序列。通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(Systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域。DNA传感器以DNA为敏感元件，通过换能器将DNA与其他物质之间作用的生物学信号转变为可检测的光、电、声波等物理信号。近年来，DNA传感器在基因诊断、环境监控、药物研究等领域的应用研究受到广泛重视。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的上述缺陷，提供一种黄曲霉毒素B1核酸适配体和DNA传感器以及试剂盒，能够实现操作简单、灵敏度高、成本低的黄曲霉毒素B1的检测。为了实现上述目的，本专利技术提供一种黄曲霉毒素B1核酸适配体，该核酸适配体具有如下核苷酸序列：5’-GTTmmmmmmmTGTTGTCTCTCTGTGTCTnnnnnnnTTCGCTAGGCCCACA-3’(SEQIDNO：1)；其中，每个m和n各自独立地为A、T、C或G且m链段和n链段互补配对。本专利技术还提供一种DNA传感器，该DNA传感器由以下三部分组成：(1)DNA(A)：通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA模板：5’-XaACCCAACCCGCCCTACCCXb-3’(SEQIDNO：2)；其中，Xa和Xb分别代表a和b个任意碱基，且a+b＝40-80；(2)DNA(B)：上述的黄曲霉毒素B1核酸适配体；(3)DNA(C)：RCA引物，所述DNA(C)的长度为25-50nt且序列具有以下特征：5’端的15-30个碱基与DNA(A)固定序列的5’侧翼互补配对，3’端的10-20个碱基与DNA(B)的5’端互补配对。其中，所述DNA(A)固定序列为位于Xa和Xb之间的序列，由于DNA(A)为环状DNA模板，因此，所述DNA(A)固定序列的5’侧翼不限于Xa中的一部分，也可以包括Xb中的至少一部分。所述固定序列的互补序列在氯化血红素的存在下，可以催化ABTS的氧化。本专利技术中，所述RCA是指滚环扩增(rollingcircleamplification，RCA)，该术语的含义和技术步骤为本领域技术人员公知。优选地，所述DNA(A)具有如下核苷酸序列：5’-ACTGATATTAACCCAACCCGCCCTACCCATTTCTTGTTTCGTATCATTGCGAATACCGTG-3’(SEQIDNO：3)。优选地，所述DNA(C)具有如下核苷酸序列：5’-TAATATCAGTCACGGTATTCTTTTCCAGCACGGGAAC-3’(SEQIDNO：4)。或者优选地，所述DNA(C)具有如下核苷酸序列：5’-TAATATCAGTCACGGTATTCTTTTCACAACAGCACGGGAAC-3’(SEQIDNO：5)。再或者优选地，所述DNA(C)具有如下核苷酸序列：5’-TAATATCAGTCACGGTATTCTTTTCAGAGACAACAGCACGGGAAC-3’(SEQIDNO：6)。本专利技术所述DNA传感器通过混合上述三种组分进行自组装即可获得。本专利技术还提供一种试剂盒，该试剂盒包括以下组分：(1)黄曲霉毒素B1提取液；(2)DNA传感器溶液；(3)DNA聚合酶；(4)ABTS还原态无色底物；(5)氯化血红素溶液(hemin溶液)；(6)双氧水；(7)HEPES缓冲液；其中，DNA传感器溶液包括以下组分：上述DNA传感器、RCA反应液和dNTP。其中，所述DNA传感器溶液中DNA(A)、DNA(B)和DNA(C)的浓度均优选为10-1000nM，进一步优选为20-100nM。其中，所述黄曲霉毒素B1提取液可以为任何能够溶解黄曲霉毒素B1的溶液，优选为甲醇溶液，所述甲醇溶液的浓度可以根据需要确定，例如，可以为70％甲醇溶液。其中，所述双氧水可以为常规的各种浓度，例如为30％的双氧水。本专利技术中，所述RCA反应液可以为商购DNA聚合酶时所带的反应液，也可以为根据该反应原理配置而成的反应液(330mMTris-醋酸(37℃下pH为7.9)，100mM醋酸镁，660mM醋酸钾，1％(v/v)吐温20，10mMDTT)。本专利技术的试剂盒采用一步竞争法，首先组装出含有黄曲霉毒素核酸适配体的DNA传感器，样品中游离的黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素核酸适配体DNA(B)特异性结合，使其从DNA传感器上脱落，从而触发DNA传感器，通过RCA技术得到信号的放大。RCA产物链上有n段可以催化底物ABTS氧化，从无色变为绿色的DNA序列。从而实现肉眼检测。根据竞争性原理，如果样品中的游离黄曲霉毒素B1量多，则脱落下来的黄曲霉毒素核酸适配体多，同时触发的DNA传感器多，进而有多的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄曲霉毒素B1核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体具有如下核苷酸序列：5’‑GTTmmmmmmmTGTTGTCTCTCTGTGTCTnnnnnnnTTCGCTAGGCCCACA‑3’；其中，每个m和n各自独立地为A、T、C或G且m链段和n链段互补配对。

【技术特征摘要】
1.一种黄曲霉毒素B1核酸适配体，其特征在于，该核酸适配体具有
如下核苷酸序列：
5’-GTTmmmmmmmTGTTGTCTCTCTGTGTCTnnnnnnnTTCGCTAGGC
CCACA-3’；其中，每个m和n各自独立地为A、T、C或G且m链段和n
链段互补配对。
2.一种DNA传感器，其特征在于，该DNA传感器由以下三部分组成：
(1)DNA(A)：通过以下DNA序列5’端和3’端连接而成的环状DNA
模板：5’-XaACCCAACCCGCCCTACCCXb-3’；其中，Xa和Xb分别代表a
和b个任意碱基，且a+b＝40-80；
(2)DNA(B)：权利要求1所述的黄曲霉毒素B1核酸适配体；
(3)DNA(C)：RCA引物，所述DNA(C)的长度为25-50nt且序列具有
以下特征：5’端的15-30个碱基与DNA(A)固定序列的5’侧翼互补配对，3’
端的10-20个碱基与DNA(B)的5’端互补配对。
3.根据权利要求2所述的DNA传感器，其中，所述DNA(A)具有如
下核苷酸序列：
5’-ACTGATATTAACCCAACCCGCCCTACCCATTTCTTGTTTCGTATC
ATTGCGAATACCGTG-3’。
4.根据权利要求2所述的DNA传感器，其中，所述DNA(C)具有如
下核苷酸序列：
5’-TAATATCAGTCACGGTATTCTTTTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晶珠，毛瑜，
申请(专利权)人：深圳市坤健创新药物研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44