本发明专利技术涉及一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)‑β‑D‑葡聚糖的单链DNA适配子，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)‑β‑D‑葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。根据本发明专利技术实施例的一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)‑β‑D‑葡聚糖的单链DNA适配子，可以鉴别、诊断深部真菌感染，为深部真菌感染的鉴别诊断提供了新的思路，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子微生物学和感染免疫领域，具体涉及特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子及其筛选方法和试剂。
技术介绍
深部真菌感染(invasivefungalinfection,IFI)是致病型真菌侵犯皮下组织、黏膜和脏器所引起的真菌感染性疾病。目前抗生素和免疫抑制剂的不规范使用以及侵袭性医疗手段的广泛使用，医院内深部真菌的感染率呈现升高趋势，其高致死率亦引起医务人员的高度重视。而早期诊断与治疗是降低深部真菌致死率的有效手段。真菌培养当前仍为诊断深部真菌感染的金标准，然而深部真菌取材困难以及真菌培养周期较长等因素均不利于对其快速诊断；而目前应用较为广泛的G试验仍存在一些弊端：标本的采集质量要求较高、一些药物的使用、链球菌血症等，易造成假阳性。因此临床亟待一种能够特异性鉴别真菌感染性且操作简易的新方法。而白色念珠菌为临床最为常见的导致深部感染的真菌。而真菌细胞壁中葡聚糖约占真菌细胞壁干重的60％，且(1,3)-β-D-葡聚糖约占葡聚糖总量的84％。而真菌细胞壁内(1,3)-β-D-葡聚糖为水溶性较差的多糖类物质，而糖类抗原免疫原性较差，抗体制备较为困难，难于用常规的免疫学方法检测。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提出一种可以鉴别、诊断深部真菌感染的特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子。根据本专利技术的一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。根据本专利技术实施例的一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子，可以鉴别、诊断深部真菌感染，为深部真菌感染的鉴别诊断提供了新的思路，具有良好的应用前景。另外，根据本专利技术上述实施例的一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子，还可以具有如下附加的技术特征：进一步地，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示核苷酸序列经替换、缺失和/或插入一个或几个核苷酸形成的具有SEQIDNO.1或SEQIDNO.2同等功能的序列。进一步地，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列以SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示核苷酸序列为核心，并向两边延长。本专利技术的另一目的在于提出一种含有上述特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的试剂。本专利技术的另一目的在于提出一种筛选如权1所述的特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖单链DNA适配子的方法。根据本专利技术的一种筛选上述特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖单链DNA适配子的方法，包括如下步骤：S101：合成特异性引物，并通过特异性引物合成起始单链DNA文库；S102：将所述起始单链DNA文库进行不对称PCR扩增，以得到单链DNA文库和双链DNA文库；S103：提取白色念珠菌体内的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标；S104：以所述(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，通过SELEX技术进行梯度筛选，以得到特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子；其中，所述特异性引物为：5’-GCGGAATTCGAACAGTCCGAGCC-3’和‘5-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’，所述起始单链DNA文库为：5’-GCGGAATTCGAACAGTCCGAGCC-N60-GGGTCAATGCGTCATA-3’，所述起始单链DNA文库中的N60表示60个随机核苷酸序列。进一步地，在S103步骤中，提取分子量为1.3kD～1.5kD的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标。进一步地，在步骤S102中，在进行不对称PCR扩增过程中包括单链DNA文库的变性、单链DNA文库的退火和单链DNA文库的延伸，并将所述单链DNA文库的退火过程循环预定次数，以得到双链DNA文库，并以所述双链DNA文库为模板，扩增出下一轮筛选的单链DNA文库，其中，每一轮扩增过程中，所述单链DNA文库的退火过程的循环次数都不同。进一步地，在步骤S104中，所述梯度筛选的具体过程为：在第1轮～第3轮筛选时取1μg/mL的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，在第4轮～第6轮筛选时取0.1μg/mL的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，在第7轮～第9轮筛选时取0.01μg/mL的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，在第10轮～第12轮筛选时取0.001μg/mL的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，并从第6轮筛选开始到第12轮筛选通过健康人体的血浆和聚苯乙烯微孔进行反向筛选。进一步地，在第12轮筛选过后，回收双链DNA，并用EcoRI和BamHI对所述双链DNA进行双酶切，以得到酶切产物。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1A是酶解后(1,3)-β-D-葡聚糖行SDS-PAGE后经糖原染色鉴定示意图；图1B是酶解后(1,3)-β-D-葡聚糖行波长扫描鉴定；图1C和图1D是气相色谱法鉴定酶解后(1,3)-β-D-葡聚糖；图2是双链DNA文库的扩增；图3是12轮PCR扩增单链文库；图4A是不同适配子文库相对结合力的比较；图4B是第12轮适配子文库中30个单克隆适配子相对结合力的比较；图5A是适配子AD1的二级结构；图5B是适配子AU1的二级结构；图5C是适配子AU1与AD1对靶标表位的竞争检测；图6是双适配子夹心法检测深部真菌患者血浆中(1,3)-β-D-葡聚糖；图7是双适配子夹心法检测法的ROC曲线。具体实施方式下面结合实验数据和具体实施例进一步阐述本专利技术。需要说明的是，这些实施例仅用于解释本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例1：材料的选择试剂和仪器：白色念珠菌ATCC10231购于武汉大学培养物典藏中心；白色念珠菌培养基购于青岛海博生物技术公司；pUC19质粒、DH5α菌种由本实验室冻存；用于克隆构建的主要试剂BamHI、EcoRI、T4DNA连接酶购自Fermentas公司；蛋白marker(Cat:SM1861)购于宝柯生物公司；DNAmarker购于东盛生物公司；AxyPrep质粒DNA小量试剂盒购于AXYGEN公司；DNA凝胶回收试剂盒购自AxyPrep公司；PCRmix购于TIANGEN公司；波长扫描仪(贝克曼-库尔特)；核酸蛋白检测仪(德国EPPENDORF公司)；紫外透射仪(BioimagingSystem美国UVP公司)；台式离心机、PCR仪(德国EPPENDORF公司)；单链DNA文库及引物由Invitrogen公司合成；化学试剂均为分析纯，购自国药化工。随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物合成：该文库为长度为99碱基的ssDNA文库，两端为固定序列，中间60个核苷酸为随机序列，库容量约为1014～1015。两个引物中分别含EcoRI和BamHI的酶切位点,随机ssDNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)‑β‑D‑葡聚糖的单链DNA适配子，其特征在于，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)‑β‑D‑葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子，其特征在于，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。2.一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子，其特征在于，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示核苷酸序列经替换、缺失和/或插入一个或几个核苷酸形成的具有SEQIDNO.1或SEQIDNO.2同等功能的序列。3.一种特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子，其特征在于，该特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的核苷酸序列以SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示核苷酸序列为核心，并向两边延长。4.一种含有如权利要求1～3任一项所述的特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子的试剂。5.一种筛选如权1所述的特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖单链DNA适配子的方法，其特征在于，包括如下步骤：S101：合成特异性引物，并通过特异性引物合成起始单链DNA文库；S102：将所述起始单链DNA文库进行不对称PCR扩增，以得到单链DNA文库和双链DNA文库；S103：提取白色念珠菌体内的(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标；S104：以所述(1,3)-β-D-葡聚糖作为筛选靶标，通过SELEX技术进行梯度筛选，以得到特异性结合白色念珠菌中(1,3)-β-D-葡聚糖的单链DNA适配子；其中，所述特异性引物为：5’-GCG...
【专利技术属性】
技术研发人员：华影，唐晓磊，
申请(专利权)人：阜阳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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