发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种白念珠菌SMT3基因的用途及缺失SMT3基因的白念珠菌减毒株。本发明专利技术公开了白念珠菌SMT3基因的用途，为用于制备smt3/smt3缺失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。本发明专利技术还公开了一种白念珠菌减毒株，所述减毒株中SMT3基因不表达。本发明专利技术通过对白念珠菌中SMT3基因的敲除，研究了其在细胞周期以及形态发生及转换过程中的功能，最后通过小鼠系统感染实验确立了SMT3在白念珠菌毒性表现中的重要功能。
【技术实现步骤摘要】
-种白念珠菌SMT3基因的用途及缺失SMT3基因的白念珠 菌减毒株
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种白念珠菌SUM0的SMT3基因的用途及缺 失SMT3基因的白念珠菌减毒株。
技术介绍
白念珠菌（Candidaalbicans)是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真 菌，特别在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅 部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等，也可以侵 入表皮和内皮细胞进入血液而到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导 致死亡（Odds,F.C. 1994.J.Am.Acad,Dermatol. 31:S2-S5.)。白念珠菌在不同的生长条 件下，有不同的生长形态，这些不同形态之间可以在一定条件下进行转换。包括酵母态 (yeastform)，和菌丝态（hyphae)，以及白菌（whitephase)和灰菌（opaquephase)之 间的转换。这种形态转化能力直接影响白念珠菌的致病能力（Odds,F.C. 1985.CritRev Microbiol. 12:45-93;Brown,A.J.P.etal. 1999.TrendsMicrobiol. 7:334-338.),形态转 换能力缺陷的菌株其系统感染能力大大下降或消失（Lo,H.J.etal，Cell90:939-949.)。 白-灰转换首先在临床上分离的W0-1菌株中发现。这两种形态的菌也具有不同的致病性， 白囷在系统感染中具有较强的致病能力，而灰囷在表皮感染中具有较强的致病能力。因而 白灰转换是念珠菌为了适应不同的微环境而产生的两种形态，这两种形态对于念珠菌的致 病能力有重要作用。同时，白灰转换对于白色念珠菌实现其交配也是必要的。与酿酒酵母 类似，白色念珠菌为了实现同源重组，需要经过一个交配的过程，有研究表明白念珠菌灰菌 形态交配效率大约是白菌形态的1〇 6倍，因此，白色念珠菌要实现交配，首先要进行白灰转 换，由白菌转换为灰菌形态，才可以实现交配。 现有技术已通过功能互补的方法找到了调控白色念珠菌白灰转换的关键性因子， Worl(White-OpaqueRegulatorl)，Worl在念珠菌白灰形态转换中起着关键性的调控作 用。在随后的Worl调控网络研究中，我们通过酵母双杂交筛选并且鉴定了一些与之相互作 用的蛋白，其中包括两个含有特征性的SP-RING结构的SUMOE3连接酶。 SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier,小泛素相关修饰物）是二十多年前 发现的一种可逆的蛋白翻译后修饰，在此之后，许多参与SUM0化修饰以及去SUM0化过程的 酶被发现和鉴定。与此同时，对于SUM0化底物的寻找也得出一系列可以发生SUM0化修饰 的蛋白，这些蛋白参与到细胞功能的各个环节。 SUM0化修饰是一个高度动态化的过程，其结果因具体蛋白而异，包括改变蛋白的 定位，调控蛋白的活性，以及在某些情况下影响蛋白的稳定性。乍一看这些结果似乎没有什 么共同性；但其实这些结果都源自SUM0化修饰对于蛋白质的相互作用特性的改变。 SUM0在酿酒酵母中的研究已经很成熟，但在白念珠菌中的已有研究还比较鲜见。 StephenW.Martin等人对白念珠菌细胞周期中Septin的行为进行了研究。他 们的研究表明，虽然白念珠菌中Septin不发生SUMO化修饰，但SUMO却特异性地定位于Septin;进一步的研究表明，Septin的一个组分Cdcll能够与一个SUMO化的蛋白结合，从 而使其定位于Septin。 MichelleD.Leach等人在白念珠菌中发现了大约30个SUMO化修饰的革巴蛋白，其 中大多数是具有典型的SUM0化修饰模式W-K-X-E，这些蛋白主要涉及到对外界各种刺激 的应答过程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过基因敲除的方法，研究SMT3基因在细胞周期、形态发生及 转换过程中的功能，并且提供一种缺失SMT3基因的白念珠菌减毒株。 本专利技术首先公开了白念珠菌SMT3基因的用途，为用于制备SMT3基因不表达的白 念珠菌smt3/smt3缺失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。 本专利技术的SMT3基因含有如SEQIDN0:18所示的核苷酸序列，其在白念珠菌中编 码SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier泛素相关小修饰蛋白）。 较优的，所述SUM0蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0 :19所示。 较优的，本专利技术所述smt3/smt3缺失株为白念珠菌的减毒株。在所述白念珠菌 smt3/smt3缺失株中SMT3基因不表达。 本专利技术所述白念珠菌治疗药物为以SMT3基因为治疗靶基因，使SMT3基因不表达 的药物、或者以SMT3基因表达的蛋白（SUM0)为拮抗对象的药物；或者以SMT3基因和其他 基因共同作为靶基因加以沉默的药物。通过以SMT3基因为靶点，筛选或制备使该基因不表 达的药物，用于使白念珠菌的毒性减弱，从而治疗白念珠菌感染。例如，该白念珠菌治疗药 物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使SMT3基因不表达；或者通过制备SMT3蛋白拮 抗剂，使SMT3基因表达的SUM0不发挥作用。 本专利技术第二方面公开了一种白念珠菌减毒株，为白念珠菌smt3/smt3缺失株，所 述减毒株中SMT3基因不表达。 进一步的，本专利技术的白念珠菌减毒株属于泛素相关小修饰蛋白基因缺失株。 较优的，本专利技术所述白念珠菌smt3/smt3缺失株中，SMT3基因通过同源重组的方 法敲除。与野生型白念珠菌相比，本专利技术的减毒株在生长方面出现严重缺陷，即便是在丰富 培养基中也只能缓慢生长，并且伴随菌落及细胞形态方面的异常。同时，在白灰转换实验 中，smt3/smt3对促进白灰转换的刺激条件不敏感，白灰转换效率比同样处理的野生型显著 降低，而且形成的灰菌菌落不稳定，在低温条件下也能转换到白菌状态或者丝状生长状态。 本专利技术第三方面公开了前述白念珠菌减毒株的构建方法，为通过同源重组的方法 对白念珠菌中SMT3基因的两个拷贝进行了敲除，具体步骤如下： 1) SMT3基因第一个拷贝的敲除：采用SEQ ID N0 :1-2所示序列的引物从白念珠 菌野生型菌株基因组DNA中扩增SMT3的上游序列片段，利用Xhol+PstI酶切连接到载体 PCUB6中，得到质粒pK0-SMT3Up ;然后以SEQ ID N0:3-4所示序列的引物从白念珠菌野生型 菌株基因组中扩增得到SMT3的下游序列I，以BamHI+Notl酶切连接到前述pK0-SMT3Up 中，得到敲除质粒PSMT3K0 I ;将所述敲除质粒pSMT3K0 I酶切后转化白念珠菌，经细胞内 同源重组得到第一拷贝SMT3敲除的单敲除菌株； 2)SMT3基因第二个拷贝的敲除：采用SEQIDNO:1-2所示序列的引物从白念珠 菌野生型菌株基因组DNA中扩增SMT3的上游序列片段，利用Xhol+PstI酶切连接到载体 PCUB6中，得到质粒pK0-SMT3Up;然后以SEQIDN0:3、5所示序列的引物从白念珠菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
白念珠菌SMT3基因的用途，为用于制备SMT3基因不表达的白念珠菌smt3/smt3缺失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。
【技术特征摘要】
1. 白念珠菌SMT3基因的用途，为用于制备SMT3基因不表达的白念珠菌smt3/smt3缺 失株，或者用于制备、筛选白念珠菌治疗药物。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，SMT3基因含有如SEQ ID NO: 18所示的核苷 酸序列。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，SMT3基因在白念珠菌中编码泛素相关小修 饰蛋白。4. 一种白念珠菌减毒株，为白念珠菌smt3/smt3缺失株，所述减毒株中SMT3基因不表 达。5. 如权利要求4所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，所述白念珠菌减毒株为泛素相 关小修饰蛋白基因缺失株。6. 如权利要求5所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，所述泛素相关小修饰蛋白含有 SEQ ID NO : 19所示的氨基酸序列。7. 如权利要求4所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，所述白念珠菌smt3/smt3缺失株 中，SMT3基因通过同源重组的方法敲除。8. 权利要求4-7任一权利要求所述白念珠菌减毒株的构建方法，为通过同源重组的方 法对白念珠菌中SMT3基因的两个拷贝进行了敲除，具体步骤如下： 1. SMT3基因第一个拷贝的敲除：采用SEQ ID N0:l-2所示序列的引物从白念珠菌野生 型菌株基因组DNA中扩增SMT3的上游序列片段，利用Xhol + PstI酶切连接到载体pCUB6 中，得到质...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈江野，鄢明辉，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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