本发明专利技术属于癌症的分子诊断领域，具体涉及一种检测癌症部位的方法和试剂盒：向含有癌细胞或者癌组织的体系中加入光激活适配子荧光探针，探针与癌细胞上的靶标特异性地结合，孵育一段时间后，将多余探针洗去，使用激光共聚焦荧光显微镜对待测样品进行扫描并拍照，得到光激活前的荧光图像；随后，使用一定波长的激发光照射待测样品，使探针被光激活，使用激光共聚焦荧光显微镜对待测样品进行扫描并拍照，得到光激活后的荧光图像；最后，将光激发前后的信号图像进行比较，荧光增强的部位即为癌症部位。具有很高的灵敏度；另外，荧光小分子只有在光激活后才会转变成荧光很强的结构，这一定程度上克服了光漂白的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子诊断领域，具体涉及一种具有光激活性能的适配子探针及利用该探针检测癌症部位的方法。
技术介绍
癌症被认为是世界范围内发病和死亡的主要原因之一。恶性肿瘤能够不受控制地增长，进而干预到消化系统、神经系统和循环系统。更糟糕的是，它们能释放出激素来改变身体的功能。癌症难以检测，因为它生长于器官本身，人体的免疫系统不能将其识别和清除。大部分癌症患者在发病前，并没有明显的临床症状。然而一旦恶性肿瘤形成，病人的身体状况会急剧恶化。传统的癌症检测手段包括计算机断层扫描(CT)、核磁造影(MRI)和正电子放射层造影术等方法，这些方法均需要从肿瘤形态学变化上来观察，不能满足癌症早期检测的要求。发展从分子水平上区分癌症部位与正常部位的方法，对于癌症的早期诊断和及时治疗都有着非常重要的意义。目前，与癌症相关的肿瘤标识物已经逐渐被看作是衡量和评估癌症早期诊断的标准。例如，人类表皮生长因子受体2(HER2)已被视为重要的乳腺癌预后因子而用于乳腺癌的诊断治疗过程中。核酸适配子是人工合成的单链寡核苷酸(DNA或RNA),它们能够与非核苷酸靶目标物质进行高亲和力、高特异性的结合。由于能够特异性地识别特定的目标分子，且具有易于合成、化学稳定性高和生物相容性好等优点，适配子被视为是癌症检测中抗体的可靠替代品。光激活技术最初起源于光激活的荧光蛋白。近期，研究人员设计合成出光
激活的有机小分子，可以通过光激发来改变化合物的结构，进而使其荧光大幅度增强。由于通过光激活能够使原先荧光很弱的位置的荧光变强，该方法可以被应用于成像领域中。
技术实现思路
为了区分癌症部位与正常部位，本专利技术提供一种具有光激活性能的适配子探针，所述探针是与癌细胞特异性结合的适配子DNA序列，其5’端修饰有光激活荧光基团，光激活荧光基团是具有光敏性能的荧光小分子，在外源激发光激发后，荧光基团的荧光强度会增强。进一步地本专利技术提供的光激活性能的适配子探针的结构式如式(II)所示：式(II)中的DNA序列如SEQ NO.1所示。本专利技术的另一个目的是提供一种将上述具有光激活性能的适配子探针用于定位癌症部位的方法，其包括如下步骤：(1)向待测体系中加入具有光激活性能的适配子探针，37℃孵育30-120分钟，使用PBS缓冲溶液洗脱2遍，得到待测样品；(2)将待测样品置于激光共聚焦显微镜下扫描，得到的光激发前的荧光信号图；(3)使用365nm～488nm范围内的激发光照射待测样品，使适配子DNA序列末端的小分子荧光增强；(4)将光激发后的待测样品再次放到激光共聚焦显微镜下扫描，得到的光激发后的荧光信号图；(5)将光激发前后的信号图进行比较，荧光增强的部位即为癌症部位。进一步地，本专利技术提供上述具有光激活性能的适配子探针在制备靶向定位癌细胞的试剂盒中的应用。所述具有光激活性能的适配子探针在制备靶向杀灭癌细胞的药物中的应用。所述的具有光激活性能的适配子探针在制备癌细胞体外识别、分离和鉴定的试剂盒中的应用。所述的具有光激活性能的适配子探针在制备分离或鉴定癌症生物标记物的试剂盒中的应用。本专利技术具有以下优点和有益效果：本专利技术的检测癌症部位的方法中，设计的每一个适配子探针都针对一个特定的癌症相关的肿瘤标识物，可以有效地靶向癌症部位，具有良好的选择性和普适性；使用了光激活前后的信号差减法，可以达到很高的图像信噪比，具有很高的灵敏度，可以用来检测微量的肿瘤标识物；另外，荧光小分子只有在光激活后才会转变成荧光很强的结构，这一定程度上克服了光漂白的问题。因此，利用光激活适配子荧光检测来作为信号输出具有真实可靠的特点。附图说明图1为光激活适配子荧光探针的合成示意图图2为光激活适配子荧光检测癌细胞的示意图。图3为光激活前后适配子探针结构变化的结构示意图。图4为光激活前后适配子探针的荧光变化图。图5为探针对MCF-7乳腺癌细胞和CHO正常细胞(对照)成像的荧光图。图6为探针对癌腺癌组织和乳腺增生组织成像的荧光图。图7为光激活荧光探针与普通荧光探针组织成像的荧光对比实验。图a为荧光图；图b为光激活适配子探针光激活时的荧光变化；图c为相同适配子序列的普通荧光探针光激活时的荧光变化。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。若无特别说明，本专利技术中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知的常规操作。【实施例1】光激活适配子荧光检测体系的设计(1)叠氮修饰的适配子N3-AS1411序列合成如图1所示，叠氮修饰的DNA序列来自上海生工公司合成，探针是参考适配子AS1411序列合成的，该DNA的序列为：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG(SEQ NO.1)，3’端为叠氮修饰。(2)光激活荧光基团——TokyoGreen小分子的合成含有羧基的TokyoGreen小分子化合物的合成参考了以下文献：T.Kobayashi,Y.Urano,M.Kamiya,T.Ueno,H.Kojima and T.Nagano,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,6696-6697.得到以下荧光分子：(3)带有炔基的化合物ACTG的合成——TokyoGreen的衍生化合成方法为：将化合物(I)(52.6mg,0.1mmol)、EDCI(20mg,0.1mmol)和HOAT(7mg,0.05mmol)溶于5mL DMF中，再在室温搅拌的情况下，将溶有炔丙胺(11mg,0.2mmol)的DMF溶液(1mL)滴加入体系中，氩气保护，室温反应12h。反应结束后，将溶液真空离心浓缩，硅胶柱层析分离，用二氯甲烷和甲醇(V/V＝97:3)为淋洗剂，收集第一条带，旋干溶剂，得到橙色固体ACTG 39mg，产率70％。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ1.75(s,3H,J＝4.2Hz),2.02(d,3H),2.29(s,1H),4.19(d,2H,J＝2.1Hz),4.58(s,1H),6.18(q,1H,J＝6Hz),6.40(s,1H),6.53(d,1H,J＝9.9Hz),6.71(t,1H,J＝8.1Hz),6.80-6.96(m,4H),7.07(d,1H,J＝8.4Hz),7.26(s,1H),7.48(t,1H,J＝7.5Hz),7.63(t,1H,J＝6Hz),7.71(d,1H,J＝6.9Hz),8.06(d,1H,J＝8.1Hz)；13C NMR(75MHz,CDCl3):δ19.9,23.3,28.7,67.2,
71.7,71.8,72.3,78.9,102.5,102.7,105.7,105.7,112.2,113.4,113.6,114.8,114.9,116.7,118.8,125.0,126.1,127.0,128.8,129.4,130.3,134.2,137.6,138.4,147.2,148.5,154.0,154.2,157.7,158.6,161.7,167.4,185.7.HRMS(ESI):calcd for C33H26N2O7[M+H]+:563.18128,found:563.18228.(4)光激活适配子荧光探针CTG-AS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有光激活性能的适配子探针，其特征在于，所述探针是与癌细胞特异性结合的适配子DNA序列，其5’端修饰有光激活荧光基团，光激活荧光基团是具有光敏性能的荧光小分子，在外源激发光激发后，荧光基团的荧光强度会增强。
【技术特征摘要】
1.一种具有光激活性能的适配子探针，其特征在于，所述探针是与癌细胞特异性结合的适配子DNA序列，其5’端修饰有光激活荧光基团，光激活荧光基团是具有光敏性能的荧光小分子，在外源激发光激发后，荧光基团的荧光强度会增强。2.根据权利要求1所述的具有光激活性能的适配子探针，其特征在于，所述的光激活性能的适配子探针的结构式如式(II)所示：3.根据权利要求2所述的具有光激活性能的适配子探针，其特征在于，式(II)中的DNA序列如SEQ NO.1所示。4.权利要求1-3任一项所述的具有光激活性能的适配子探针在制备靶向定位癌细胞的试剂盒中的应用。5.权利要求1-3任一项所述的具有光激活性能的适配子探针在制备靶向杀灭癌细胞的药物中的应用。6.权利要求1-3任一项所述的具有光激活性能的适配子探针在制备癌细...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖珩，周燕，周翔，陈玉琪，李娓，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。