从生物流体中分离微小RNA制造技术

本公开提供用于从生物流体中分离miRNA的方法和试剂盒。具体地说，所述方法包括使生物流体与表面活性剂和抗miRNA结合蛋白试剂接触，其中所述表面活性剂使生物流体组分解离并且所述抗miRNA结合蛋白试剂与和miRNA缔合的miRNA结合蛋白相互作用从而形成免疫沉淀miRNA复合物；并且将miRNA从所述免疫沉淀miRNA复合物中释放。进一步提供可与循环miRNA缔合的miRNA结合蛋白的实例。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及从生物流体中分离微小RNA的方法。背景微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA，其通过经由特定碱基配对相互作用来对特定信使RNA(mRNA)靶标进行转录后调控而影响基因调控网络。miRNA已被证明以无细胞形式存在于人生物液体中。这些无细胞miRNA可为非囊泡的、由miRNA-蛋白质复合物中的蛋白质来结合并保护、封闭于膜结合囊泡诸如外来体或微泡中，或两种情况同时存在。鉴于miRNA在疾病中的重要功能作用，此组核酸分子含有候选物，所述候选物用于诊断和预后疾病，并且在各种患者和表现疾病之前的受试者中，在易于得到的生物样品，诸如血清和血浆、尿液或唾液中监测对于治疗的响应。当前分离miRNA的方法针对细胞和组织中的相对丰富的miRNA，使用不容易自动化或扩大规模的吸附柱，较复杂并且涉及毒性化合物，或可能特定地分离囊泡或非囊泡miRNA。此外，在诊断或预后方面受到关注的miRNA经常以低丰度存在于生物流体中，使得使用当前分离方法来对其进行检测具有挑战性。因此，需要用于分离生物流体中的全部或大部分miRNA的简单、有效、可自动化和可规模化的方法。专利技术概述本公开的一个方面提供从生物流体中分离微小RNA(miRNA)的方法。所述方法包括使生物流体与表面活性剂和抗miRNA结合蛋白试剂接触，其中表面活化剂使生物流体组分解离并且抗miRNA结合
蛋白试剂与和miRNA缔合的miRNA结合蛋白相互作用从而形成免疫沉淀miRNA复合物。所述方法还包括将miRNA从免疫沉淀miRNA复合物中释放。本公开的另一个方面包涵用于从生物流体中分离微小RNA的试剂盒。试剂盒包括表面活性剂、抗miRNA结合蛋白试剂和miRNA释放试剂。本公开的其它方面和重复在以下更详细描述。附图简述图1提供将使用TriBD或RNA免疫沉淀反应(RIP)从0.2ml血浆分离miRNA进行比较的两个图表。通过RIP分离的miRNA的量表示为使用TriBD分离的miRNA的倍数差异。(A)描绘let-7a-5p、23a-3p和191-5p miRNA的水平，并且(B)示出142-3p和451a miRNA的水平。图2提供展示使用Ago-RIP或Qiagen柱纯化试剂盒(Q1，Q2)从血浆分离的miRNA的水平的三个图表。展示let-7a、23a和142miRNA(A)、191miRNA(B)和451a miRNA(C)的以洗脱miR拷贝数/μl为单位的分离miRNA的量。图3提供展示使用利用生物素化(b-Ago2或b-Ago)或非生物素化(Ago2)抗体与链霉抗生物素蛋白或蛋白质A珠粒进行的RIP从血浆分离的miRNA的水平的三个图表。展示了let-7a(A)、23a(B)和191(C)miRNA的以洗脱miR拷贝数/μl为单位来表示的分离miRNA的量。所使用的抗体(圆括号中的克隆)在x轴上表示。图4提供展示使用伴以放热的Ago-RIP从血浆分离的miRNA的水平的两个图表。Q代表Qiagen柱纯化；RIP-Q代表免疫沉淀反应随后Qiagen柱纯化；bRIP-Q代表使用生物素化抗体的免疫沉淀反应随后Qiagen柱纯化。(A)描绘使用Qiagen柱纯化、与柱纯化组合的
RIP和伴以蛋白水解酶K释放的RIP的合成cel-miR-39-3p跟踪标定物的水平。跟踪标定物的水平表示为在分离期间跟踪标定的合成cel-miR-39-3p的总百分比。(B)描绘使用Qiagen柱纯化、与柱纯化组合的RIP和具有蛋白水解酶K释放的RIP的从血浆分离的let7a miRNA的水平。let7a的水平以1μl回收样品中的let7a的拷贝数来表示。图5提供展示使用在不同温度下伴以蛋白水解酶K释放的Ago-RIP从血浆分离的miRNA的水平的两个图表。(A)描绘由蛋白水解酶K释放的let7a miRNA的水平(在每个温度下的左侧棒)，和保持于珠粒上的水平(在每个温度下的右侧棒)。let7a miRNA的水平表示为在使用Qiagen的miRNeasy血清/血浆试剂盒来分离的0.2ml相同血浆中的let7a miRNA的总百分比。(B)描绘由蛋白水解酶K释放的miR451a miRNA的水平(在每个温度下的左侧棒)，和保持在珠粒上的水平(每个温度下的右侧棒)。miR451a miRNA的水平表示为在使用Qiagen的miRNeasy血清/血浆试剂盒来分离的0.2ml相同血浆中的miR451a miRNA的总百分比。图6提供展示使用可购得的miRNA分离方法，或使用在标准试管中伴以蛋白水解酶K释放的RIP的分离从血浆中分离的let7a(A)或miR451a(B)miRNA的水平的两个图表。E1和E2代表使用来自Exiqon的miRCury RNA分离试剂盒-生物流体的miRNA分离。Q1和Q2代表使用来自Qiagen的miRNeasy血清/血浆试剂盒的miRNA分离。RIP-std-Q代表免疫沉淀反应随后Qiagen柱纯化。miRNA的水平表示为从0.2ml血浆回收的总拷贝数。图7提供展示使用可购得的miRNA分离方法，或使用伴以蛋白水解酶K释放的Ago-RIP的分离(RIP1-4)从血浆中分离的let7a miRNA的水平的两个图表。(A)示出试验1并且(B)示出试验2。E1和E2代表使用来自Exiqon的miRCury RNA分离试剂盒-生物流体的miRNA分离。Q1和Q2代表使用来自Qiagen的miRNeasy血清/血浆试剂盒的miRNA分离。let7a的水平表示为从0.2ml血浆回收的let7a
的总拷贝数。图8提供展示在存在或不存在蛋白水解酶和RNA酶抑制剂的情况下，以及在存在或不存在清洁剂预处理的情况下，使用Ago-RIP随后蛋白水解酶K释放从血浆中分离的miRNA的水平的两个图表。+pre，+inh；将Igepal和抑制剂添加至血浆并且孵育～30分钟，然后添加至Ago2-珠粒。+pre，-inh；在没有抑制剂的情况下将Igepal添加至血浆并且孵育～30分钟，然后添加至Ago2-珠粒。-pre，+inh；Igepal和抑制剂与Ago2-珠粒同时添加至血浆。-pre，-inh；Igepal在没有抑制剂的情况下与Ago2-珠粒同时添加至血浆。(A)描绘回收的let7a miRNA的拷贝数，并且(B)描绘回收的miR451a miRNA的拷贝数。图9提供展示作为总IGEPAL处理miRNA的百分比的自由(每个miRNA的左侧棒)和囊泡(每个miRNA的右侧棒)指示miRNA的水平的图表。图10提供展示使用Ago-RIP随后蛋白水解酶K释放(RIP)从0.2或0.4ml血浆中，或使用来自Exiqon的miRCury RNA分离试剂盒-生物流体(E)从0.2ml血浆中分离的miRNA的水平的三个图表。(A)描绘回收的let7a miRNA的拷贝数，(B)描绘回收的miR191miRNA的拷贝数，并且(C)描绘回收的miR451a miRNA的拷贝数。图11提供展示使用Ago-RIP随后蛋白水解酶K释放从血浆中分离的let7a的水平的图表。RIP孵育是在室温下历时5、15、30或60分钟(5’、15’、30’、60本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从生物流体中分离微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括(a)使所述生物流体与表面活性剂和抗miRNA结合蛋白试剂接触，其中所述表面活性剂使生物流体组分解离并且所述抗miRNA结合蛋白试剂与和miRNA缔合的miRNA结合蛋白相互作用从而形成免疫沉淀miRNA复合物；和(b)在未纯化的情况下使miRNA从所述免疫沉淀miRNA复合物中释放。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.27 US 61/909,834;2014.04.28 US 61/985,0001.一种用于从生物流体中分离微小RNA(miRNA)的方法，所述方法包括(a)使所述生物流体与表面活性剂和抗miRNA结合蛋白试剂接触，其中所述表面活性剂使生物流体组分解离并且所述抗miRNA结合蛋白试剂与和miRNA缔合的miRNA结合蛋白相互作用从而形成免疫沉淀miRNA复合物；和(b)在未纯化的情况下使miRNA从所述免疫沉淀miRNA复合物中释放。2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物流体包括囊泡miRNA和非囊泡miRNA。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述生物流体是血浆或血清。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生物流体同时与所述表面活性剂和所述抗miRNA结合蛋白试剂接触。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中将所述生物流体、所述表面活性剂和所述抗miRNA结合蛋白试剂孵育约30分钟。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在室温下孵育所述生物流体、所述表面活性剂和所述抗miRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：C克里德，
申请(专利权)人：西格马奥尔德里奇有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US