一体化微小RNA荧光定量检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一体化微小RNA荧光定量检测试剂盒及其应用。具体地，本发明专利技术的用于检测微小RNA的试剂盒，包含：(a)用于对微小RNA进行polyA加尾反应和逆转录反应的第一试剂组，包括：用于催化加尾反应的酶、用于催化逆转录反应的酶、用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液、以及逆转录引物；和(b)用于进行PCR荧光定量检测的第二试剂组，包括：用于PCR扩增反应的下游通用引物，所述的下游通用引物特异性结合于所述逆转录引物的通用序列区。采用本发明专利技术的试剂盒，可以将微小RNA加尾以及逆转录这两步反应合二为一。本发明专利技术可用于miRNA、siRNA及piRNA的定量检测,具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物学和医学研究及临床诊断领域，具体涉及微小RNA荧光定量检测试剂盒，及其在组织标本或血液样品中微小RNA的荧光定量检测等方面的应用。
技术介绍
微小RNA，包括microRNA(miRNA)、small interfering RNA(siRNA)以及piwi-interacting RNA(piRNA)，是一类长约18-30个核苷酸的非编码单链小分子RNA。miRNA广泛存在于动物、植物、线虫等真核生物中，通过与靶基因mRNA的3’非编码区特异性结合，降解靶mRNA或者抑制靶基因翻译，从而导致靶基因表达减少。miRNA参与机体诸多生理过程及病理变化，调节胚胎发育、器官形成、细胞分裂、细胞增殖、细胞凋亡、干细胞更新和分化等生理过程。大量研究表明，miRNA的异常表达与疾病发生密切相关，miRNA具有潜力，可作为基因干预靶点或者基因药物用于临床治疗，也可作为分子标志物用于疾病早期诊断或者预后。siRNA也广泛存在于真核细胞中，但内源性siRNA较少，大多是合成的外源性siRNA，导入细胞，达到基因沉默的目的。siRNA作为基因治疗手段，国外已批准多项临床试验。piRNA大量存在于生殖细胞，曾经被认为是生殖细胞特异表达，近期研究表明piRNA在肿瘤细胞和干细胞也有微量表达。piRNA对保障生殖细胞遗传信息的稳定性具有重要作用。可见，微小RNA功能广泛，具有重要的临床应用价值。微小RNA不论在科学研究或在临床应用，不论是作为疾病治疗靶点，还是作为疾病早期诊断标志物，都需要一种快速、准确、灵敏的定量检测方法。目前微小RNA表达的检测方法主要有四种：(1)Northern blot技术、(2)原位杂交技术、(3)基因芯片技术、和(4)荧光定量PCR技术。Northern blot技术因为样本RNA需求量大，需要同位素标记探针才能达到高灵敏度检测，无法做到绝对定
量，所以大多数用于研究所和实验室，不适于临床快速定量检测。原位杂交技术因为程序复杂，探针杂交特异性低，微小RNA表达信号弱，也无法实现液体样本的检测，这些都限制了其应用和推广。基因芯片技术适于表达谱的高通量检测，但因为假阳性率高，对其结果需要有一种更准确的方法验证。只有荧光定量PCR方法，准确性好，灵敏度高，检测速度快，被广泛应用于微小RNA的定量检测。微小RNA属于RNA，根据基因扩增原理，RNA必须经过逆转录(RT)反应，催化反应变成cDNA，才能作为模板实现多聚酶链式反应(PCR)扩增以及定量检测。与常规mRNA不同，微小RNA具有以下关键特征：(1)长度很短，只有18-30个碱基；(2)缺乏poly(A)尾巴；(3)序列差异小，有些miRNA之间只有1个碱基差别。鉴于这些特征，常规的mRNA逆转录方法和PCR扩增条件都不适于miRNA，这是因为：一方面oligo(dT)引物不能完成逆转录反应，另一方面，太短序列无法设计前后两条引物。现有技术中，一种对微小RNA进行荧光定量检测方法是茎环(stem-loop)引物法。该方法需要一条特殊结构的逆转录引物，一端序列可自体形成茎环结构，另一端序列可与待测miRNA 3’端互补配对。然而，在该方法中，为了使逆转录反应具有微小RNA特异性，对于每种微小RNA都需要设计特异的逆转录引物，所以检测成本高，不适于广泛应用。另一种对微小RNA进行荧光定量检测方法是poly(A)聚合酶加尾法。在该方法中，先在微小RNA 3’端人为添加poly(A)尾巴，再以Oligo(dT)引物完成逆转录反应。该方法灵敏度高、一次逆转录就可以合成所有微小RNA的cDNA，尤其适合于微小RNA的表达谱检测和高通量筛选。然而，该方法存在以下缺点：(1)需要两步反应完成cDNA的合成，第一步是给微小RNA进行poly(A)加尾，第二步是利用Oligo(dT)引物完成逆转录反应；(2)一次检测过程耗时长，通常需要约4-6小时；(3)仅用于miRNA检测，尚未用于其他微小RNA(包括siRNA及piRNA)的检测；(4)3’端通用引物特异性不够高，容易产生非特异扩增。因此，本领域尚迫切需要开发更为简便、高效、特异性地对微小RNA进行荧光定量检测方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种更简便、高效、特异性地对微小RNA进行荧光定量检测方法和试剂盒。本专利技术的第一方面，提供一种用于检测微小RNA的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)用于对微小RNA进行polyA加尾反应和逆转录反应的第一试剂组，其中，所述第一试剂组包括：用于催化加尾反应的酶、用于催化逆转录反应的酶、用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液、以及逆转录引物；所述的逆转录引物具有式I所示的从5’至3’的结构：X-Y-Z (I)式中，X为长度为15-30个碱基的通用序列区；Y为长度为10-20个碱基的oligo(dT)区；Z为分别选自下组的三种单核苷酸区：dA、dC、dG；(b)用于进行PCR荧光定量检测的第二试剂组，其中，所述的第二试剂组包括：用于PCR扩增反应的下游通用引物，并且，所述的下游通用引物特异性结合于所述逆转录引物的通用序列区。在另一优选例中，所述的下游通用引物的序列与所述逆转录引物的通用序列区完全互补。在另一优选例中，所述的下游通用引物的序列与所述逆转录引物的通用序列区不完全互补。在另一优选例中，所述的下游通用引物的长度为15-30个碱基，较佳地为17-25个碱基，更佳地为18-22个碱基。在另一优选例中，X为长度为17-25个碱基(较佳地18-22个碱基)的通用序列区；和/或Y为长度为12-18个碱基(较佳地13-17个碱基)的oligo(dT)区。在另一优选例中，所述的Z的长度为1个碱基。在另一优选例中，所述的逆转录引物为间并引物，其中含dA、dC、dG的三种引物的摩尔比为1～2：1～2:1～2。在另一优选例中，所述的用于催化加尾反应的酶选自下组：RNA poly(A)聚合酶；和/或所述用于催化逆转录反应的酶选自下组:SuperScript逆转录酶。在另一优选例中，所述Poly A聚合酶和RNA逆转录酶的比例改为3：1-1：2，较佳地2.5：1至1：1.5。在另一优选例中，所述的用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液为5X缓冲液，其中所述5X缓冲液中钾离子的浓度为200-600mM，较佳地为300-500mM，更佳地为
400±40mM。在另一优选例中，所述的用于加尾反应和逆转录反应的5X缓冲液中镁离子的浓度为50-200mM，较佳地为100-200mM，更佳地为150±20mM。在另一优选例中，所述的用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液中钾离子与镁离子的摩尔比为2～6:0.5～2，较佳地为3-5：1-2。在另一优选例中，所述的用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液具有选自下组的一个或多个特征：(i)缓冲液含有的缓冲成分包括或由下组构成：250mM Tris；400mM KCl；和150mM MgCl2；(ii)pH为8.3。在另一优选例中，所述的第一试剂组还包括选自下组的一种或多种成分：(a1)加尾反应的底物；(a2)逆转录反应的底物。在另一优选例中，所述的第一试剂组还包括选自下组的底物成分：5-20nM Oligo(dT)间并引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测微小RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：(a)用于对微小RNA进行polyA加尾反应和逆转录反应的第一试剂组，其中，所述第一试剂组包括：用于催化加尾反应的酶、用于催化逆转录反应的酶、用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液、以及逆转录引物；所述的逆转录引物具有式I所示的从5’至3’的结构：X‑Y‑Z     (I)式中，X为长度为15‑30个碱基的通用序列区；Y为长度为10‑20个碱基的oligo(dT)区；Z为分别选自下组的三种单核苷酸区：dA、dC、dG；(b)用于进行PCR荧光定量检测的第二试剂组，其中，所述的第二试剂组包括：用于PCR扩增反应的下游通用引物，并且，所述的下游通用引物特异性结合于所述逆转录引物的通用序列区。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测微小RNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：(a)用于对微小RNA进行polyA加尾反应和逆转录反应的第一试剂组，其中，所述第一试剂组包括：用于催化加尾反应的酶、用于催化逆转录反应的酶、用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液、以及逆转录引物；所述的逆转录引物具有式I所示的从5’至3’的结构：X-Y-Z (I)式中，X为长度为15-30个碱基的通用序列区；Y为长度为10-20个碱基的oligo(dT)区；Z为分别选自下组的三种单核苷酸区：dA、dC、dG；(b)用于进行PCR荧光定量检测的第二试剂组，其中，所述的第二试剂组包括：用于PCR扩增反应的下游通用引物，并且，所述的下游通用引物特异性结合于所述逆转录引物的通用序列区。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，X为长度为17-25个碱基(较佳地18-22个碱基)的通用序列区；和/或Y为长度为12-18个碱基(较佳地13-17个碱基)的oligo(dT)区；和/或所述的逆转录引物为间并引物，其中含dA、dC、dG的三种引物的摩尔比为1～2：1～2:1～2。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于催化加尾反应的酶选自下组：RNA poly(A)聚合酶；和/或所述用于催化逆转录反应的酶选自下组:SuperScript逆转录酶。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于加尾反应和逆转录反应为5X缓冲液，其中在5X缓冲液中钾离子的浓度为200-600mM，较佳地为300-500mM，更佳地为400±40mM。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，在另一优选例中，所述的用于加尾反应和逆转录反应的5X缓冲液中镁离子的浓度为50-200mM，较佳地为100-200mM，更佳地为150±20mM。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的用于加尾反应和逆转录反应的缓冲液具有选自下组的一个或多个特征：(i)缓冲液含有的缓冲成分包括或由下组构成：250mM Tris；400mM KCl；和150mM MgCl2；(ii)pH为8.3。7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，
申请(专利权)人：默金斯上海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31