ERCC2基因突变检测特异性引物和液相芯片试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种ERCC2基因突变检测液相芯片和特异性引物，该液相芯片主要包括有：每种由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列为：针对G934A位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、针对T128G位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、针对C2133T位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和针对A396C位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明专利技术所提供的检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，能实现多个突变位点的野生型和突变型的单独或并行检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种ERCC2基因突变检测特异性引物和液相芯片试剂盒。
技术介绍
ERCC2(excision repair cross complementation group2)，位于第19号染色体19q13.3位置，共23个外显子，基因全长19.0kb，mRNA全长2355bp，编码含761个氨基酸的蛋白质。由ERCC2编码的蛋白质参与转录偶联的核苷酸切除修复，它和识别与修复结构无关的大范围的损伤，如大的加合物和胸腺嘧啶二聚体，并且是基本转录因子复合物BTF2/TFIIH的一个组成部分。该蛋白具有ATP依赖性的DNA解旋活性，属于RAD3/XPD解旋酶亚家族。ERCC2的功能缺失导致基本转录因子复合物不能正确识别DNA损伤位点，从而使碱基切除修复无法正常进行，导致DNA上的致癌损伤累积。ERCC2基因的突变或者失活可能导致的疾病包括：癌症、着色性干皮病、毛发硫营养不良、柯凯因氏综合征等。目前，ERCC2基因多态性的检测技术主要有：基于PCR技术的Real-time PCR、PCR-RFLP等技术，基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALDI-TOF-MS)以及免疫组化技术(IHC)。PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术是一种软电离技术，在蛋白质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身的特殊性，检测受到一定的限制。免疫组化虽具有特异性、敏感性强及操作简单等优点，但其抗体使用、操作步骤、结果判断等没有统一标准，从而影响其在临床上的推广与应用。液相芯片，又称流式荧光技术、悬浮阵列，具有检测速度快、结果准确性高、操作简便、功能强大、成本低廉等诸多优点。然而，要液相芯片实现基因突变检测，其检测结果的影响参数较多，包括引物的设计、与tag序列的组合，与PCR引物之间的交叉反应、与其它位点的多条序列的交叉反应、整个检测平台的Tm值的协调等等，在针对目标基因突变检测的液相芯片的设计时，其关键的考虑因素是除了能单独进行检测，还必须能与其它位点进行同步
检测。而目前，急需开发一种既然单独检测，又能实现并行检测的ERCC2基因突变检测液相芯片。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供ERCC2基因突变检测液相芯片试剂盒，该液相芯片试剂盒可用于单独或并行检测ERCC2基因4种常见基因型G934A、T128G、C2133T和A396C的野生型和突变型。实现上述目的的技术方案如下。一种ERCC2基因突变检测液相芯片试剂盒，包括有：(A).针对ERCC2基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列选自以下至少一对：针对G934A位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、针对T128G位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、针对C2133T位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和针对A396C位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、与所述ASPE引物具有相应突变位点的目标序列的引物。在其中一些实施例中，所述扩增引物选自以下至少一对：针对G934A位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、针对T128G位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对C2133T位点的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、和针对A396C位点的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32。在其中一些实施例中，所述ASPE引物对选自以下至少一对：针对G934A位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10组成的序列，针对T128G位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.12组成的序列，针对C2133T位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.13组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14组成的序列，和针对A396C位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.16组成的序列。本专利技术的另一目的是提供用于ERCC2基因突变检测的特异性引物。实现上述目的的技术方案如下：用于ERCC2基因突变检测的特异性引物，选自以下至少一对：针对G934A位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、针对T128G位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、针对C2133T
位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和针对A396C位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16。本专利技术的主要优点在于：1.本专利技术所提供的ERCC2基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法吻合率高达100％，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的ERCC2基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，特异性引物、tag标签序列、anti-tag标签序列的选取，构建了一个检测参数统一的检测平台，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的单独和并行检测。2.本专利技术通过专利技术人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合，本专利技术设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3％；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。3.本专利技术的检测方法步骤简单，5种突变位点检测可通过一步PCR即可完成4条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。4.本专利技术不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ERCC2基因突变检测液相芯片试剂盒，其特征在于，包括有：(A).针对ERCC2基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列选自以下至少一对：针对G934A位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、针对T128G位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、针对C2133T位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和针对A396C位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8；(B).有anti‑tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti‑tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti‑tag序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24，且所述anti‑tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、与所述ASPE引物具有相应突变位点的目标序列的引物。

【技术特征摘要】
1.一种ERCC2基因突变检测液相芯片试剂盒，其特征在于，包括有：(A).针对ERCC2基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列选自以下至少一对：针对G934A位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、针对T128G位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、针对C2133T位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和针对A396C位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、与所述ASPE引物具有相应突变位点的目标序列的引物。2.根据权利要求1所述的ERCC2基因突变检测液相芯片试剂盒，其特征在于，所述扩增引物选自以下至少一对：针对G934A位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、针对T128G位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对C2133T位点的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、和针对A396C位点的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32。3.根据权利要求2所述的ERCC2基因突变检测液相芯片试剂盒，其特征在于，所述ASPE引物对选自以下至少一对：针对G934A位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10组成的序列，针对T128G位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.12组成的序列，针对C2133T位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.13组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14组成的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴诗扬，廖传荣，刘志明，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44