一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参考物及核酸含量分析方法技术

一种用于核酸含量分析的质粒参考物的构建方法，是将核酸样品的内标基因和待检测基因，又称外源基因共同构建到质粒载体中，替代基因组DNA，实现对待测样品的含量确定。连入到质粒的两个片段中间含有酶切位点，质粒DNA提取纯化后，用限制性内切酶通过上述酶切位点将环状的质粒参考物切割为线性片段，以此降低两个片段的相互干扰，提高扩增效率和核酸含量分析结果的精准度，尤其是应用于基于实时荧光定量PCR方法的核酸含量分析过程。

Plasmid reference substance and nucleic acid content analysis method for analysis of nucleic acid content of transgenic maize

A construction method for plasmid reference nucleic acid content analysis, the sample of nucleic acid target genes to be detected and gene, also known as exogenous gene to the plasmid construct, alternative genomic DNA, realize the content to the sample determination. Even into two fragments of intermediate plasmid containing restriction sites, purification of plasmid DNA extracted by plasmid with restriction endonuclease restriction sites of the reference ring cutting into linear segments, in order to reduce the interference between the two segments, improve the efficiency and the content of nucleic acid amplification analysis results accuracy, especially the application of the nucleic acid content of real-time fluorescence quantitative PCR method based on process analysis.

【技术实现步骤摘要】
一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参考物及核酸含量分析方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参考物及核酸含量分析方法。
技术介绍
随着转基因作物及相关产品在全世界范围内的迅速发展，其环境安全和食用安全问题一直受到各国政府和广大消费者及相关检测机构人员的重视。目前，根据ISAAA机构统计，全球获批生产的转基因玉米已有149种，对转基因玉米的核酸进行分析测试，并保证结果的准确、可靠和有效性，需要阳性参考物的支撑。在保证转基因检测结果的可比性、溯源性，推进转基因产品检测方法标准化等方面，转基因生物参考物发挥着十分重要的作用。参考物或阳性对照是转基因生物检测监管中进行质量控制的关键，目前转基因检测用阳性对照主要依赖研发者提供，出于自身经济利益考虑，研发者向检测机构提供的阳性样品量一般不大，难以满足转基因生物安全监管工作的需要,因此，构建质粒分子作为阳性样品用于转基因玉米核酸含量分析不失为一种有效的手段。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参考物及核酸含量分析方法。本专利技术所采用的技术方案在于：一种质粒，所述质粒包括内标准基因和外源基因，所述内标准基因和外源基因之间存在单一酶切位点。一种参考物质粒的制备方法，所述方法包括在含有内标准基因和外源基因的质粒中插入单一酶切位点，具体的，所述插入单一酶切位点为在内标准基因和外源基因之间插入单一酶切位点；或，所述方法包括将含有内标准基因、单一酶切位点和外源基因的核苷酸片段连入克隆载体中。一种核酸含量分析和/或基因检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的质粒。所述质粒、所述方法制备的参考物质粒和/或所述试剂盒在核酸含量分析和/或基因检测中的应用。所述质粒和/或所述方法制备的参考物质粒在制备核酸含量分析和/或基因检测试剂和/或试剂盒中的应用。附图说明图1为本专利技术的一种实施方式中，构建的质粒DNA的内标准基因和外源基因中间有一个酶切位点，经限制性内切酶切割后，形成线性DNA，内标准基因和外源基因分布在了线性片段的两段，从而形成了质粒参考物，进行实时荧光定量PCR反应。图2为转基因玉米检测用质粒pBJGMM005的酶切后凝胶电泳检测结果，其中泳道1和6代表100bpLadder的检测结果，泳道2代表环状质粒DNA的检测结果，泳道3-5代表酶切后线性质粒DNA的检测结果(平行做了3次酶切)。具体实施方式以下结合附图对本专利技术作进一步的描述。(实施例中所用的原料应能够从商业途径获得，如不可从商业途径获得，请提供该原料的制备方法，如该原料的制备方法中所用的材料不可从商业途径得到，该材料的制备方法也得提供；或者将该原料替换为具有相同作用的可从商业途径得到的其它产品)下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例1：下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实验材料及试剂：下述实施例中所用的转基因样品均来自以下两个标准物质研制中心：欧盟IRMM及美国AOCS。下述实施例中所用的克隆载体pEASY购于北京全式金生物技术有限公司。实施例1、质粒参考物pBJGMM005的构建及验证(一)质粒参考物pBJGMM005的构建(1)内标准基因序列的确定内标准基因选择的原则是，具备物种特异性，且为单拷贝基因。在玉米中，选择alcoholdehydrogenase1(alc1)基因为内标准基因，核苷酸序列为见序列表中的SEQID№.1，对应的引物对与探针见表1。表1玉米内标准基因的引物及探针信息玉米内标准基因的引物及探针信息反应体系见表2。表2玉米内标准基因的反应体系扩增条件见表3。表3玉米内标准基因的扩增条件(2)外源基因的序列的确定外源基因即指的是通过基因功能手段插入玉米基因组的基因。本实施例中，选用转基因玉米GA21为实验对象，该玉米的外源基因检测方法参考了欧盟的JRCQT-EVE-ZM-014，核苷酸序列见序列表中的SEQID№.2。引物和探针见表4表4转基因玉米GA21玉米引物及探针信息反应体系见表5。表5转基因玉米GA21的反应体系(3)质粒参考物中单一酶切位点的确定酶切位点必须是质粒参考物中单一的位点，也就是内标准基因、外源基因、质粒载体上均不存在此位点。将上述步骤(1)确定的内标准基因、步骤(2)确定的外源基因和质粒载体(具体本实施例1选用克隆载体pEASY作为质粒载体)的核苷酸序列在NEBcutterV2.0的网页中进行酶切位点预测，然后根据NEB酶的目录，找到一个常用的酶，且该常用酶的酶切位点在上述NEBcutterV2.0的酶切位点预测结果中不存在。具体本实施例1选用BglII位点。(4)质粒参考物pBJGMM005的制备将内标准基因、外源基因、酶切位点通过基因合成的方式，一次性合如pEASY的TA克隆位点，从而得到质粒参考物，命名为pBJGMM005。(二)质粒参考物pBJGMM005的验证利用相应的内标准基因和外源基因引物对质粒pBJGMM005的两个基因进行验证，检验构建质粒是否扩增预期的所有片段。内标准基因扩增引物、外源基因扩增引物的序列、反应体系和扩增条件参加表1-5。结果如图2，外源插入基因和内标准基因均可被检测到。实施例2、线性和环状质粒参考物的比较(1)环状质粒参考物的酶切通过碱裂解法(可以选用商品化的试剂盒，也可以按照分子克隆书籍配置)提取上述实施例1制备得到的pBJGMM005质粒DNA，将提取后的DNA进行限制性酶切，酶切体系见表6：表6BglII酶切体系反应条件：温度依据酶说明书要求，反应3h。反应产物可以在-20℃下保存。质粒参考物pBJGMM005经上述酶切反应后，制备得到一线性载体，内标准基因和外源基因分别分布在该线性载体的两端。(二)线性和环状质粒参考物的比较实时荧光定量PCR扩增验证，PCR反应体系见表3。PCR仪器：BioRadCFX96。反应程序见表7。表7PCR反应体系表7中：正向反向引物序列与探针参见表4。体系参见表5，反应程序参见表3。模板DNA1为质粒参考物pBJGMM005；模板DNA2为本实施例步骤(一)制备的线性载体。对反应完成后的PCR反应体系进行稀释，共选取5个稀释梯度用作标准曲线，前三个点为10倍稀释，后两个点为5倍稀释，稀释后的拷贝数分别为：5×104，5×103，5×102，100，20copies/μl。由所做的标准曲线可得出，所构建的标准质粒分子的环状和线性的定量PCR扩增效率，结果见表8。表8线性和环状扩增质粒参考物扩增效率比较由表8实验结果可见，线性质粒参考物扩增效率在90％-110％之间，且接近100％，标准差仅为2％，符合国家标准《转基因植物及其产品成分检测——实时荧光定量PCR方法制定指南》(农业部2259号公告-5-2015)的要求；而环状质粒参考物的扩增效率均值在83.91％，低于国家标准的要求，标准差为8.7％，表示结果不稳定。故此，证明了本研究所采用的构建方法所获得的质粒及核酸含量分析方法具有较理想的效果。实施例3、转基因玉米GA21中的核酸含量分析分别以pBJGMM005质粒DNA的线性及环状质粒参考物为阳性标准物质，对欧盟发售的转基因玉米GA21标准物质BF414d(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种质粒，所述质粒包括内标准基因和外源基因，其特征在于，所述内标准基因和外源基因之间存在单一酶切位点。

【技术特征摘要】
1.一种质粒，所述质粒包括内标准基因和外源基因，其特征在于，所述内标准基因和外源基因之间存在单一酶切位点。2.一种参考物质粒的制备方法，所述方法包括在含有内标准基因和外源基因的质粒中插入单一酶切位点，具体的，所述插入单一酶切位点为在内标准基因和外源基因之间插入单一酶切位点；或，所述方法包括将含有内标准基因、单一酶切位点和外源基因的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亮，董美，金芜军，宛煜嵩，刘卫晓，李凯，王迪，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11