本发明专利技术涉及分子生物学，具体公开了一种高通量的利用竞争性等位基因PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)方法检测含NOS终止子的转基因玉米的引物及方法。所述引物如SEQ ID No.1～4所示，为了适用于KASP反应检测，在正向引物的5’端连接荧光标签序列。利用本发明专利技术所提供的引物进行检测，一次检测样本量最高可达5376个，检测的通量要大大地优于普通PCR和TaqMan探针法荧光定量PCR；检测时，只需要扫描PCR产物的荧光信号就可以判断结果，而不需要进行电泳，简单快捷；KASP反应利用的是通用型的探针，相比TaqMan探针法荧光定量PCR，极大节省了成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体地说，涉及利用KASP技术检测含NOS终止子的转基因玉米的引物及方法。
技术介绍
对转基因作物及其产品的检测是转基因生物安全管理的基础。目前大部分转基因作物品种都含有NOS终止子这个外源成分，因此对NOS终止子的筛查是转基因检测当中最重要的检测项目之一。目前常用的转基因的检测方法为普通PCR技术和荧光定量PCR技术，但二者均存在不足与缺陷，限制了转基因检测的推广。普通PCR技术需要电泳以及紫外观察的过程，操作繁琐，耗时长，难以实现高通量检测。荧光定量PCR技术的不足包括：(1)检测成本昂贵。荧光定量PCR使用的荧光探针是基因特异性探针，成本很高。如果探针的效果不好，还需要重新设计探针。(2)难以实现高通量检测。一般情况下，一台荧光定量PCR仪器一次只能做96或者384个反应，能检测的样本数量有限，不适合大批量检测。(3)自动化程度不高。目前情况下，构建荧光定量PCR反应体系的过程主要依靠手工操作，容易导致实验误差和实验污染。因此，亟需开发一种高通量、低成本、简单快捷以及低错误率的转基因作物的检测方法。竞争性等位基因PCR(kompetitiveallelespecificPCR，KASP)是一种基于荧光检测的基因分型技术。进行检测的时候，每个反应孔采用双色荧光(一般是FAM荧光和HEX荧光)检测样本某一位点可能的两种基因型。该技术现阶段主要被应用于SNP基因分型研究中，成为分子辅助育种、性状基因的精细定位以及种子资源鉴定的主要技术手段。但是目前尚未见到利用KASP技术来检测含NOS终止子的转基因玉米的报道。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种高通量检测含NOS终止子的转基因玉米的引物及方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供了用于检测含NOS终止子的转基因玉米的引物组合，包括：(1)NOS终止子特异性检测引物：NOS终止子正向引物：5’-CGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’；NOS终止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；(2)内源基因zSSIIb特异性检测引物：zSSIIb正向引物：5’-ATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’；zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’。进一步地，为了适用于KASP反应检测，在上述正向引物的5’端连接荧光标签序列，如下：(1)NOS终止子特异性检测引物：连接FAM荧光标签序列的NOS终止子正向引物：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’(下划线处是FAM标签序列)；NOS终止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；(2)内源基因zSSIIb特异性检测引物：连接HEX荧光标签序列的zSSIIb正向引物：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’(下划线处是HEX标签序列)；zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’。检测内源基因的目的在于监控DNA提取和KASP反应等过程中是否出现了问题。进一步地，含有前述引物组合的试剂和试剂盒也在本专利技术的保护范围之内。第二方面，本专利技术提供了前述引物组合在检测含NOS终止子的转基因玉米中的应用。具体可体现为一种检测含NOS终止子的转基因玉米的方法，包括如下步骤：S1、提取样品基因组DNA；S2、以基因组DNA为模板，利用前述引物组合进行KASP反应检测；其中，NOS终止子正向引物的5’端连接FAM荧光标签序列，zSSIIb正向引物的5’端连接HEX荧光标签序列；即：连接FAM荧光标签序列的NOS终止子正向引物：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’(下划线处是FAM标签序列)；NOS终止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；连接HEX荧光标签序列的zSSIIb正向引物：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’(下划线处是HEX标签序列)；zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’；S3、KASP反应结束后检测产物的荧光信号，如果从样品中仅检测到HEX荧光，则判定该样品为不含NOS终止子的玉米；如果从样品中同时检测到HEX荧光和FAM荧光时，则判定该样品为含NOS终止子的玉米。作为优选，本专利技术优化了KASP反应的反应条件如下：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个TouchDown循环(每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃)；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。满足上述条件的KASP反应，能提高扩增产物的特异性。进一步地，本专利技术优化了KASP反应的反应体系，具体为：反应体系组分终浓度体积(μL)100μMNOS终止子正向引物0.17μM0.0051100μMNOS终止子反向引物0.42μM0.0126100μMzSSIIb正向引物0.17μM0.0051100μMzSSIIb反向引物0.42μM0.01262xKASPMasterMix1x1.5超纯水1.4646总体积3(注：为节省反应体积，DNA模板已经提前加入到PCR反应板中并且烘干。)更进一步地，为了提高检测结果的准确性，本专利技术检测方法中还设有正对照模板，负对照模板以及空白对照。其中，正对照模板为含NOS终止子的转基因玉米DNA以及含NOS终止子的质粒；负对照模板为不含NOS终止子的非转基因玉米DNA；空白对照为水。通过LGCSNPLine仪器平台的replicator或者96通道的移液器将玉米样品及其对照样品的DNA转移到384孔反应板中，DNA样品分配之后，反应板在2000rpm离心5分钟，然后放在65℃温箱里干燥30分钟，之后取出备用。KASP反应完成后利用LGCSNPLine仪器平台的Pherastar对KASP反应产物进行扫描并且将收集到的荧光信号转化成样品基因分型的散点图。在散点图中，横坐标是代表是KASP反应产物的FAM荧光值，纵坐标代表的它的HEX荧光值。根据样品产物荧光值可以判断它们是否含有NOS终止子。如果从某样品中仅检测到HEX荧光，则判定该样品为不含NOS终止子的玉米；如果从某样品中同时检测到HEX荧光和FAM荧光时，则判定该样品为含NOS终止子的玉米；当样品出现在原点附近，即该样品通过KASP反应没有生成zSSIIb或NOS终止子，表明该样品在DNA提取或者KASP反应体系构建过程中出现了问题，需要重新检测其基因型。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了对含有外源基因片段NOS终止子的转基因玉米进行KASP检测的方法以及相应的引物组合。所述引物组合中，一对引物用于扩增植物内源基因，另外一对引物用于扩增外源NOS终止子片段。在引物设计的时候，内源基因zSSIIb正向引物的5'端添加了HEX的标签序列，外源NOS终止子的正向引物的5'端添加了FAM的标签序列。本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高通量检测含NOS终止子的转基因玉米的引物组，其特征在于，包括：(1)NOS终止子特异性检测引物：NOS终止子正向引物：5’‑CGTTCAAACATTTGGCAATAAA‑3’；NOS终止子反向引物：5’‑AAGACCGGCAACAGGATTC‑3’；(2)内源基因zSSIIb特异性检测引物：zSSIIb正向引物：5’‑ATCTGCTCCGAAGCAAAGTC‑3’；zSSIIb反向引物：5’‑CACTCGTTCCGTTTTGCATT‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种高通量检测含NOS终止子的转基因玉米的引物组，其特征在于，包括：(1)NOS终止子特异性检测引物：NOS终止子正向引物：5’-CGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’；NOS终止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；(2)内源基因zSSIIb特异性检测引物：zSSIIb正向引物：5’-ATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’；zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，包括：(1)NOS终止子特异性检测引物：连接了FAM荧光标签序列的NOS终止子正向引物：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTTCAAACATTTGGCAATAAA-3’；NOS终止子反向引物：5’-AAGACCGGCAACAGGATTC-3’；(2)内源基因zSSIIb特异性检测引物：连接了HEX荧光标签序列的zSSIIb正向引物：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCTGCTCCGAAGCAAAGTC-3’；zSSIIb反向引物：5’-CACTCGTTCCGTTTTGCATT-3’。3.含有权利要求1或2所述引物组合的试剂或试剂盒。4.权利要求1或2所述的引物组合在检测含NOS终止子的转基因玉米中的应用。5.一种高通量检测含NOS终止子的转基因玉米的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、提取...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨翅春，郑秀婷，熊艳文，彭佩，
申请(专利权)人：华智水稻生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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