一种基于ddPCR的高灵敏EBV DNA定量检测试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术提供一种基于ddPCR的高灵敏EBV DNA定量检测试剂盒及使用方法，试剂盒包括DNA抽提缓冲液、PCR引物及探针、PCR反应液和EBV阴、阳性对照。使用本发明专利技术提供的试剂盒进行ddPCR检测时，能有效排除PCR设备、标准品等影响，进而实现高灵敏绝对定量。本发明专利技术提供的EBV DNA定量检测试剂盒通过ddPCR技术能够对血清、血浆中的EBV进行高灵敏精确定量，为EBV相关疾病的诊断和疗效监测提供参考依据。本发明专利技术还通过ddPCR确立EBV DNA国际标准物质的国际单位与常用单位之间的函数关系为1IU/ml=2.5Copy/ml,实现EBV DNA国际溯源，实现检测结果和定量单位的国际可比性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA检测领域，具体涉及一种基于ddPCR的高灵敏EBVDNA定量检测试剂盒及使用方法。
技术介绍
EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)又称人类疱疹病毒Ⅵ型(Humanherpesvirustype4)，属于γ疱疹病毒亚科淋巴滤泡病毒属，在人群的携带率高达90％以上，且EBV一旦感染将终身携带。EBV主要感染人类鼻咽上皮细胞和B淋巴细胞，研究表明EBV初次感染后就终身定居人类B淋巴细胞中。EBV相关疾病范围较广，大致分为血液系统和非血液系统两大类。EBV相关血液系统疾病主要包括传染性单核细胞增多症(Infectiousmononucleosis)、burkitt淋巴瘤、原发性淋巴瘤、T细胞淋巴瘤等；EBV相关非血液系统疾病主要包括胃癌、鼻咽癌、肺癌、平滑肌肉瘤等，因此EBV的检测对EBV相关疾病的诊断和治疗意义重大。目前的学术观点认为EBVDNA的存在形式有三种：①EBVDNA存在于完整EB病毒粒子的病毒基因组中；②游离的环状或线状EBVDNA；③游离EBVDNA。由于EBVDNA的存在形式有三种，因此，提取EBVDNA对于EBV的检测具有重要的影响本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于ddPCR的高灵敏EBV DNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括DNA抽提缓冲液、PCR引物及探针、PCR反应液和EBV阴、阳性对照，其中，所述DNA抽提缓冲液包括蛋白酶K缓冲液、buffer1、buffer2、buffer3和buffer4；所述buffer1包括Tris‑HCl、EDTA和盐酸胍；所述buffer2包括异丙醇、Tris‑HCl和EDTA；所述buffer3和buffer4分别包括浓度均不同的无水乙醇、Tris‑HCl和EDTA；所述PCR反应液包括5×PCR反应缓冲液，0.8‑1.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，1‑7U/μl H‑Taq DNA聚合酶；...

【技术特征摘要】
1.一种基于ddPCR的高灵敏EBVDNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括DNA抽提缓冲液、PCR引物及探针、PCR反应液和EBV阴、阳性对照，其中，所述DNA抽提缓冲液包括蛋白酶K缓冲液、buffer1、buffer2、buffer3和buffer4；所述buffer1包括Tris-HCl、EDTA和盐酸胍；所述buffer2包括异丙醇、Tris-HCl和EDTA；所述buffer3和buffer4分别包括浓度均不同的无水乙醇、Tris-HCl和EDTA；所述PCR反应液包括5×PCR反应缓冲液，0.8-1.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，1-7U/μlH-TaqDNA聚合酶；所述PCR引物及探针包括700nmol/L-1.0μmol/L用于扩增靶多核苷酸的上下游引物和0.2mol/L-0.5μmol/L用于检测靶多核苷酸的探针；所述用于检测靶多核苷酸的探针的碱基对序列为：5’FAM-CACACACTACACACACCCACCCGTCTC-BHQ13’。2.根据权利要求1所述的基于ddPCR的高灵敏EBVDNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述用于扩增靶多核苷酸的上下游引物的碱基序列为：上游引物：5’-CCCAACACTCCACCACACC-3’；下游引物：5’-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG-3’。3.根据权利要求1所述的基于ddPCR的高灵敏EBVDNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K缓冲液包括浓度为10-20mmol/L的所述Tris-HCl，浓度为1.0-3.0mmol/L的所述EDTA和浓度为10ug/ml的所述蛋白酶K，其中，所述Tris-HCl和所述EDTA的pH值均为7.5。4.根据权利要求1所述的基于ddPCR的高灵敏EBVDNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述buffer1包括浓度为40-70mmol/L的所述Tris-HCl，浓度为2.0-4.0mmol/L的所述EDTA和浓度为4.0-6.0mol/L的所述盐酸胍，其中，所述Tris-HCl和所述EDTA的pH值均为7.5。5.根据权利要求1所述的基于ddPCR的高灵敏EBVDNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述buffer2包括浓度为30％-60％的所述异丙醇，浓度为10-20mmol/L的所述Tris-HCl和浓度为1.0-3.0mmol/L的所述EDTA，其中，所述Tris-HCl和所述EDTA的pH值均为7.5。6.根据权利要求1所述的基于ddPCR的高灵敏EBVDNA定量检测试剂盒，其特征在于，所述buffer3包括浓度为50％-60％的所述无水乙醇，浓度为10-20mmol/L的所述Tris-HCl和浓度为1.0-3.0mmol/L的所述EDTA，其中，所述Tris-...

【专利技术属性】
技术研发人员：林勤，胡斌，孙鸣，洪国粦，骆启聪，廖希一，王紫晶，
申请(专利权)人：林勤，胡斌，孙鸣，洪国粦，
类型：发明
国别省市：福建;35