本发明专利技术提供了一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括如SEQ ID NO：1所示的序列，所述反向引物包括如SEQ ID NO：2所示的序列；所述荧光探针为寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括如SEQ ID NO：3所示的序列。采用本发明专利技术的技术方案，通过引入特异性荧光探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的全过程在单管内封闭完成，具有实时、准确、快速、简便的特点，无需后续处理，避免污染，为降低病死率以及控制疫情争取时间。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外核酸检测
，本专利技术提供了一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针、试剂盒及检测方法。
技术介绍
寨卡病毒（Zikavirus）是一种蚊媒病毒，于1947年首次在乌干达恒河猴中发现。属黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒，直径40-70nm，有包膜，包含10794个核苷酸，编码3419个氨基酸。寨卡病毒与同为黄病毒属的登革病毒、黄热病毒及西尼罗病毒等存在较强的血清学交叉反应。寨卡病毒可引起一种自限性急性传染病，称为寨卡病毒病，临床特征主要为发热、皮疹、关节痛或结膜炎，极少引起死亡。世界卫生组织（WHO）认为，新生儿小头畸形、格林-巴利综合征（吉兰-巴雷综合征）可能与寨卡病毒感染有关。寨卡病毒病主要在全球热带及亚热带地区流行。1952年，在乌干达和坦桑尼亚的人体中分离到该病毒。此后,多个国家有散发病例报道。2007年,首次在西太平洋国家密克罗尼西亚的雅普岛发生寨卡病毒疫情暴发。截至2016年1月，至少在非洲、亚洲、美洲的45个国家有寨卡病毒传播的证据，以巴西疫情最为严重。根据基因型别分为非洲型和亚洲型，2016年1月美洲流行的为亚洲型。我国南方部分地区存在可传播寨卡病毒的媒介伊蚊，近年来与之传播方式相似的登革热输入性疫情持续增多，并在南方部分省份引起了较大规模的暴发疫情。随着与相关国家或地区人员往来的日益密切，我国存在寨卡病毒输入风险。特别是我国南方地区夏秋季节伊蚊密度较高，一旦有病例输入，不排除在局部地区发生本地传播扩散的可能。因此，急需建立一种快速、高效、准确的检测方法和检测试剂盒。
技术实现思路
针对以上技术问题，本专利技术提供了一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，可以快速、高效、定性的检测样本中的亚洲型寨卡病毒。对此，本专利技术的技术方案为：一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括如SEQIDNO：1所示的序列，所述反向引物包括如SEQIDNO：2所示的序列，所述荧光探针为寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括如SEQIDNO：3所示的序列。正向引物：5'-AAAGGGAGCCTGGTGACATG-3'反向引物：5'-CTGGGAGCCATGAACTGACA-3'寡核苷酸探针：5'-AAGAGCATCCAGCCAGAGAATCTGG-3'。作为本专利技术的进一步改进，所述正向引物还包括SEQIDNO：1所示的序列的衍生序列；所述反向引物还包括SEQIDNO：2所示的序列的衍生序列；所述寡核苷酸探针还包括如SEQIDNO：3所示的序列的衍生序列；其中，所述衍生序列包括引物序列的互补链序列，或向5'端和3'端方向延伸一至十个以内的碱基或删减一至十个以内的碱基得到的序列。作为本专利技术的进一步改进，所述寡核苷酸探针的3’端标记有第一荧光淬灭基团，5’端标记有第一荧光报告基团。作为本专利技术的进一步改进，所述第一荧光报告基团为FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或TexasRed中的至少一种；所述第一荧光淬灭基团为BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTMRQ或LowaBlackTMFQ中的至少一种。本专利技术还公开了一种用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒包括RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包含如上所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针。作为本专利技术的进一步改进，所述RT-PCR反应液包括内标引物和内标探针，所述内标引物包括内标正向引物和内标反向引物，所述内标正向引物包含如SEQIDNO：4所示的序列，所述内标反向引物包含如SEQIDNO：5所示的序列，所述内标探针包含如SEQIDNO：6所示的序列。内标正向引物：5'-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3'；（SEQIDNO：4）内标反向引物：5'-GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3'；（SEQIDNO：5）内标探针：5'-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3'（SEQIDNO：6）。作为本专利技术的进一步改进，所述RT-PCR反应液包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种核苷酸、所述用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针、内标引物和内标探针、含有镁离子的缓冲液组成。作为本专利技术的进一步改进，所述内标探针的5’端标记有第二荧光报告基团，3’端标记有第二荧光淬灭基团。作为本专利技术的进一步改进，所述第二荧光报告基团为HEX；所述第二荧光淬灭基团为BHQ1。作为本专利技术的进一步改进，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒还包括酶混合液、内标溶液、阳性质控品、阴性质控品。作为本专利技术的进一步改进，所述酶混合液为包含有热启动的TaqDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂（RNasin）的缓冲液。作为本专利技术的进一步改进，所述阳性质控品为含有插入亚洲型寨卡病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒，所述pUC57载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度后用无菌TE缓冲液稀释。优选的，所述亚洲型寨卡病毒特异型保守序列为：AAAGGGAGCCTGGTGACATGCGCTAAGTTTGCATGCTCCAAGAAAATGACCGGGAAGAGCATCCAGCCAGAGAATCTGGAGTACCGGATAATGCTGTCAGTTCATGGCTCCCAG（如SEQIDNO：7所示）。作为本专利技术的进一步改进，阳性质控品的浓度为1.0×106copies/ml。作为本专利技术的进一步改进，所述阴性质控品为无菌TE缓冲液。进一步优选的，该所述无菌TE缓冲液采用DEPC水配制。作为本专利技术的进一步改进，所述内标溶液为含有插入人RNP基因特异型保守序列RNA片段的假病毒颗粒的溶液。优选的，所述人RNP基因特异型保守序列为：GAAGTGGGCACATCCATAGAGCACCCCAGGGAGGCAGAGGAGGTAATGGATGCAGGGTGTCAAGAATCGGCAGGGCCTGAGAGGATCACAGACCAGGAGGC（如SEQIDNO：8所示）。作为本专利技术的进一步改进，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。本专利技术还公开了一种亚洲型寨卡病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1：准备检测样品RNA模板；步骤S2：配制含有内标引物、内标探针、如上所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针的RT-PCR反应体系，对步骤S1所述的检测样品RNA模板进行扩增；其中，第一阶段反应条件为：50℃15min，95℃2min，1个循环；第二阶段反应条件为：95℃10s，6本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT‑PCR引物和荧光探针，其特征在于：所述用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT‑PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括如SEQ ID NO：1所示的序列，所述反向引物包括如SEQ ID NO：2所示的序列；所述荧光探针为寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括如SEQ ID NO：3所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于：所述用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括如SEQIDNO：1所示的序列，所述反向引物包括如SEQIDNO：2所示的序列；所述荧光探针为寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括如SEQIDNO：3所示的序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于：所述寡核苷酸探针的3’端标记有第一荧光淬灭基团，5’端标记有第一荧光报告基团。
3.根据权利要求2所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于：所述第一荧光报告基团为FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或TexasRed中的至少一种；所述第一荧光淬灭基团为BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTMRQ或LowaBlackTMFQ中的至少一种。
4.一种用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于：所述用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒包括RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包含如权利要求1~3任意一项所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针。
5.根据权利要求4所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR反应液包括内标引物和内标探针，所述内标引物包括内标正向引物和内标反向引物，所述内标正向引物包含如SEQIDNO：4所示的序列，所述内标反向引物包含如SEQIDNO：5所示的序列，所述内标探针包含如SEQIDNO：6所示的序列，其中，所述内标探针的5’端标记有第二荧光报告基团，3’端标记有第二荧光淬灭基团。
6.根据权利要求5所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于：所述第二荧光报告基团为HEX；所述第二荧光淬灭基团为BHQ1。
7.根据权利要求6所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于：所述用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒还包括酶混合液、内标溶液、阳性质控品、阴性质控品。
8.根据权利要求7所述的用于检测亚洲...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄超杰，朱海，游腾飞，付辉，卢和华，
申请(专利权)人：深圳市易瑞生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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