一种用于检测样品中牛凸隆病毒的荧光RT-PCR引物、探针和试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测牛凸隆病毒的荧光RT‑PCR引物和荧光探针，所述引物和荧光探针为针对牛凸隆病毒M基因保守序列设计的一对特异性正反向引物和荧光探针。本发明专利技术还公开了用于检测牛凸隆病毒的试剂盒及检测方法。本发明专利技术对牛凸隆病毒基因的保守序列设计一对特异性探针和引物，PCR检测为阳性时即可确诊样本感染牛凸隆病毒，具有简便、快速、特异性高、灵敏度高的特点，可用于牛活畜和肉品检疫时牛凸隆病毒的快速诊断和流行病学研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于体外核酸检测领域，尤其涉及一种用于检测样品中牛凸隆病毒(PorcineTorovirus,PToV)的荧光RT-PCR引物和探针和试剂盒及检测方法，可用于牛活畜和肉品检疫时牛凸隆病毒的快速诊断和流行病学研究。
技术介绍
凸隆病毒(Torovirus)作为套式病毒目(Nidovirairs)冠状病毒科(Coronaviridae)家族的重要成员，包括马凸隆病毒(EquineTorovirus，EToV，最初称为伯尔尼病毒)、牛凸隆病毒(BovineTorovirus，BToV，最初称为布雷达病毒)、猪凸隆病毒(PorcineTorovirus，PToV)和人凸隆病毒(HumanTorovirus，HToV)等四种标准型。凸隆病毒有囊膜病毒，表现为圆形，椭圆形、线形或者肾形，也有呈现杆状和小圆盘状的记载，最大直径为120～140nm，基因组为单股正链RNA，全长28,473kb。该病毒感染人和动物，主要引起消化道和呼吸道疾病。自1982年，美国爱荷华州爆发一场由牛凸隆病毒引发的严重腹泻以来，迄今已有30余年的历史，期间瑞士、英国、德国、南非、巴西、印度、加拿大、荷兰、澳大利亚、日本、韩国等全球不同国家和地区均有报道由凸隆病毒感染马、牛、猪、人等引起的腹泻事件，相关流行病学研究发现，该病毒在世界范围内流行，在宿主间呈现高水平的阳性率，目前我国还没有关于牛凸隆病毒相关研究的报道，及时研发出检测牛凸隆病毒快速、准确的检测试剂盒对于防止外境相关病毒的侵入具有重大意义。凸隆病毒是肠道病原体，可以感染各年龄的易感动物，包括猪、牛、马、人等，主要引起被感染动物的胃肠炎。目前被报道的检测手段包括抗原捕获-没联免疫吸附试验、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫电镜(IEM)。ELISA方法虽然是一个快速且廉价方法，但是由于目前凸隆病毒不能在细胞中培养，导致在以发病动物的排泄物或肠道内容物作为抗原来源时，实验产生较高背景，大大降低了ELISA方法的特意性和敏感性。四川农业大学于2012年申请了专利《一种猪环曲病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法》，申请号：201210398440.8，该专利采用RT-PCR方法，扩增需要采用凝胶电泳技术才能观察结果，实验周期长，操作复杂，同时采取开盖处理容易产生气溶胶污染，并不适合开发快速，便捷产品。IEM方法是一个流行病学诊断中非常重要的方法，但是由于其需要高度精密设备和较长的检测时间，加之检测成本较高，所以很难做到大范围推广和商业化。实时荧光PCR技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的全过程可以在单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果，具有实时、准确、快速、简便等特点，是一种先进的分子检测技术。目前还没有基于实时荧光PCR技术建立的牛凸隆病毒核酸检测方法及试剂盒。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种用实时荧光RT-PCR技术检测牛凸隆病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针。其是针对于牛凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)基因编码区的特异保守区域为靶标区域，设计一对特异性引物及荧光探针。本专利技术目的之二是提供一种包括上述荧光RT-PCR引物和荧光探针的试剂盒。本专利技术的目的之三是提供一种使用上述荧光RT-PCR引物和荧光探针对牛凸隆病毒的检测方法，该检测方法可以快速、定性检测样本中的牛凸隆病毒。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种用于检测牛凸隆病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于，所述荧光RT-PCR引物和荧光探针为针对牛凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)的保守序列设计的牛凸隆病毒特异性正向、反向引物和荧光探针。作为本专利技术的进一步改进，所述牛凸隆病毒正向、反向引物和荧光探针序列分别是：正向引物：5'-GCAATAAACCAYTAACAGCTGCTC-3'反向引物：5'-CTTTAGCGGCGCTGGTAGTAG-3'荧光探针：5'-TGCTGCGTTGCGGATTTGTGTTGG-3'；所述荧光探针中的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端分别标记有不同的荧光报告基团。上述引物和探针的衍生序列也为本专利技术的保护范围，所述衍生序列包括引物序列的互补链序列，同时还可以向5'端和3'端方向延伸一至十个碱基或删减一至十个碱基得到的序列。在本专利技术的一个优选实施例中，所述荧光报告基团选自FAM、JOE或ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或TexasRed；所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTMRQ或LowaBlackTMFQ。一种TaqMan探针法荧光RT-PCR检测牛凸隆病毒的试剂盒，其包含RT-PCR反应液、酶混合液、内标溶液、阴性质控品、阳性质控品,其中RT-PCR反应液含有dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种核苷酸、内标正向、反向引物、内标探针和上述检测牛凸隆病毒的牛凸隆病毒特异性正向、反向引物和荧光探针、含有镁离子的缓冲液。在本专利技术的一个优选实施例中，所述内标正向、反向引物和内标探针序列分别是：内标正向引物：5'-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3'内标反向引物：5'-GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3'内标探针：5'-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3'；所述内标探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。在本专利技术的一个优选实施例中，所述荧光报告基团选自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或TexasRed；所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTMRQ或LowaBlackTMFQ。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的酶混合液为包含有热启动的TaqDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂(RNasin)的缓冲液。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的阳性质控品为含有插入牛凸隆病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒的无菌TE缓冲液，所述阳性质控品的浓度为1.0×106copies/ml。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的阳性质控品为含有插入牛凸隆病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒的无菌TE缓冲液是将含有插入牛凸隆病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度后用无菌TE缓冲液稀释后得到。在本专利技术的一个优选实施例中，所述牛凸隆病毒特异型保守序列为：TGCAATAAACCACTAACAGCTGCTCAGGTTGCTGCGTTGCGGATTTGTGTTGGTGGACAATGGTTTGCCTATTCGCGATCAACTACTACCAGCGCCGCTAAAGT。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的无菌TE缓冲液采用DEPC水配制。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的内标溶液为含有插入人RNP基因特异型保守序列的pUC57载体质粒质粒。在本专利技术的一个优选实施例中，所述的人RNP基因特异型保守序列为：GAAGTGGGCACATCCATAGAGCACCCCAGGGAGGCAGAGGAGGTAATGGATGCAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测牛凸隆病毒的荧光RT‑PCR引物和荧光探针，其特征在于，所述荧光RT‑PCR引物和荧光探针为针对牛凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)的保守序列设计的牛凸隆病毒特异性正向、反向引物和荧光探针。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测牛凸隆病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于，所述荧光RT-PCR引物和荧光探针为针对牛凸隆病毒多聚蛋白(M蛋白)的保守序列设计的牛凸隆病毒特异性正向、反向引物和荧光探针。2.如权利要求1所述的一种用于检测牛凸隆病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于，所述牛凸隆病毒正向、反向引物和荧光探针序列分别是：正向引物：5'-GCAATAAACCAYTAACAGCTGCTC-3'反向引物：5'-CTTTAGCGGCGCTGGTAGTAG-3'荧光探针：5'-TGCTGCGTTGCGGATTTGTGTTGG-3'；所述荧光探针中的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端分别标记有不同的荧光报告基团。3.如权利要求2所述的一种用于检测牛凸隆病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于，所述荧光探针中的5’端标记的荧光报告基团选自FAM、JOE或ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或TexasRed；所述荧光探针中的3’端标记的荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTMRQ或LowaBlackTMFQ。4.一种TaqMan探针法荧光RT-PCR检测牛凸隆病毒的试剂盒，其特征在于，包含RT-PCR反应液、酶混合液、内标溶液、阴性质控品、阳性质控品,其中RT-PCR反应液含有dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种核苷酸、内标正向、反向引物、内标探针和权利要求1至3任一项权利要求所述的检测牛凸隆病毒的牛凸隆病毒特异性正向、反向引物和荧光探针、含有镁离子的缓冲液。5.如权利要求4所述的一种TaqMan探针法荧光RT-PCR检测牛凸隆病毒的试剂盒，其特征在于，所述内标正向、反向引物和内标探针序列分别是：内标正向引物：5'-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3'内标反向引物：5'-GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3'内标探针：5'-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3'；所述内标探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。6.如权利要求5所述的一种TaqMan探针法荧光RT-PCR检测牛凸隆病毒的试剂盒，其特征在于，所述内标探针的5’端标记的荧光报告基团选自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、JOE、VIC、CY3、CY5或TexasRed；所述内标探针的3’端标记的荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlackTMRQ或LowaBlackTMFQ。7.如权利要求4所述的一种TaqMan探针法荧光RT-PCR检测牛凸隆病毒的试剂盒，其特征在于，所述的酶混合液为包含有热启动的TaqDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂(RNasin)的缓冲液。8.如权利要求4所述的一种TaqMan探针法荧光RT-PCR检测牛凸隆病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品为含有插入牛凸隆病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒的无菌TE缓冲液，所述阳性质控品的浓度为1.0×106copies/ml。9.如权利要求7所述的一种TaqMan探针法荧光RT-PCR检测牛凸隆病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控品为含有插入牛凸隆病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒的无菌TE缓冲液是将含有插入牛凸隆病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度后用无菌TE缓冲液稀释后得到。10.如权利要求7所述的一种TaqMan探针法荧光RT-PCR检测牛凸隆病毒的试剂盒，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏，朱海，黄超杰，游腾飞，付辉，卢和华，毕思远，汪凤林，严义勇，
申请(专利权)人：深圳市易瑞生物技术有限公司，中国合格评定国家认可中心，
类型：发明
国别省市：广东;44