本发明专利技术提供的新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组，引物组有引物F和R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1和2的碱基序列。探针组有探针V-T和L-T,它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.3和4的碱基序列。强毒探针V-T的5＇端标记有报告荧光染料FAM，3＇端标记有淬灭荧光染料BHQ1；弱毒探针L-T的5＇端标记有报告荧光染料JOE，3＇端标记有淬灭荧光染料BHQ2。对新城疫病毒的防控具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点。
【技术实现步骤摘要】
专利技术涉及一种检测新城疫病毒强、弱毒的一步双重荧光RT-PCR试剂盒的研制，属于一种快速、灵敏的针对农产品的安全检测技术，为禽类养殖和禽产品的“绿色产业”提供技术保障；主要应用于农牧企业和监管机构，具体涉及新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒。
技术介绍
新城疫(Newcastledisease,ND)是一种由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus,NDV)引起的禽类烈性、高度接触性、致死性传染病，以侵害鸡和火鸡为主，同时也感染其他家禽和野禽，ND具有传播迅速、发病率高、病死率高的特征，同时也是困扰我国养禽业的重要疫病之一。近年来，随着ND弱毒疫苗的广泛应用，新城疫的发病情况和流行态势日趋复杂，普通的血清学诊断方法(HI试验)不能区分弱毒疫苗诱导的抗体与现场速发型强毒感染的反应，而毒力测定通常包括鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)等致病性试验，这些试验不仅需要实验动物，而且耗时费力，不能满足生产、防疫的需要,在实际应用中有一定的局限性。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。建立多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪器具有相应的多个检测通道。目前市场上还未出现检测新城疫病毒强、弱毒一步双重荧光RT-PCR的试剂盒。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏性好、特异性高、准确可靠、快速方便的新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒，同时检出新城疫病毒强、弱毒株，为新城疫的监测提供技术支撑。为解决上述问题，本专利技术采取以下技术方案：新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒包括引物组和探针组，引物组有引物F和R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1和2的碱基序列。探针组有探针V-T和L-T,它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.3和4的碱基序列。强毒探针V-T的5＇端标记有报告荧光染料FAM，3＇端标记有淬灭荧光染料BHQ1；弱毒探针L-T的5＇端标记有报告荧光染料JOE，3＇端标记有淬灭荧光染料BHQ2。引物F和R、探针V-T、探针L-T的摩尔质量比为2:2:3:1该试剂盒含有以下试剂A液：PCR扩增缓冲液、通用引物F和R、探针V-T和L-T；B液：NA-1+LaSota模板，作为阳性对照；C液：ddH2O作为阴性对照。PCR反应体系中通用引物F、R终浓度为0.4μM/L,强毒探针终浓度为0.6μM/ml,弱毒探针终浓为0.2μM/L。针对目前缺乏对新城疫病毒强、弱毒株的检测和诊断的有效可靠的技术，专利技术人通过对引物和探针不同浓度的配比，获取最佳引物和探针浓度的组合。据此建立了新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR的检测方法，并制定了检测试剂盒。实验证明，本专利技术具有以下优点：1)检测时间短应用本专利技术可实现一管二检的目的，并且反转录和PCR一步完成，仅需约1h，并且检测结果可以直接通过电脑观察，而常规的RT-PCR方法起码需要2.5h来完成扩增反应，然后还需要花40min进行琼脂糖凝胶电泳来观察结果。2)检测敏感性高且特异性强当新城疫病毒强、弱毒株同时存在时，本专利技术对其检测的Ct值与单个病毒检测的Ct值比较，其结果基本一致，并未影响对新城疫病毒强、弱毒的检出及检出的敏感性。另外利用本专利技术检测敏感性非常高，对新城疫病毒强、弱毒株分别能检测到2.3×104拷贝数和1.8×102拷贝数，该方法对新城疫病毒强毒株检测的敏感性与普通PCR方法检测敏感性相当，对新城疫病毒弱毒株检测的敏感性比普通PCR方法检测敏感性高100倍，因此该试剂盒可用于对新城疫病毒强、弱毒株的检测，本专利技术对新城疫病毒的防控具有重要意义。附图说明图1是荧光RT-PCR检测新城疫病毒强毒的敏感性实验(FAM通道)结果图：1-7分别为2.3×107～2.3×101拷贝/μL，8为空白对照。图2是荧光RT-PCR检测新城疫病毒弱毒的敏感性实验(JOE通道)结果图：1-7分别为1.8×107-1.8×101拷贝/μL，8为空白对照。图3是荧光RT-PCR检测新城疫病毒强毒的特异性实验(FAM通道)结果图：1-5分别为NA-1、NA-1+LaSota、IBV、H9N2、IBDV,6为空白对照。图4是荧光RT-PCR检测新城疫病毒弱毒的特异性实验(JOE通道)结果图：1-5分别为LaSota、NA-1+LaSota、IBV、H9N2、IBDV,6为空白对照。图5是荧光RT-PCR检测新城疫病毒强毒株NA-1的组内重复(FAM通道)结果图：1-3分别为同一批次内3个重复样品，4-6为空白对照。图6是荧光RT-PCR检测新城疫病毒弱毒株LaSota的组内重复(JOE通道)结果图：1-3分别为同一批次内3个重复样品，4-6为空白对照。具体实施方式下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：美国ABI公司stepone荧光定量PCR仪；RNA提取试剂盒(116671650001)购于罗氏生物科技有限公司；dNTP、Hs-Taq酶、MLV反转录酶等试剂购于大连宝生物公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自北京天根公司；pGEM-TEasy试剂盒购自Promega公司；T7体外转录试剂盒购自Fermengtas公司；OneStepPrimeScriptRT-PCRKit(PerfectRealTime)购自大连宝生物公司(大连TaKaRa公司)；0.1ml8StripReal-timePCRTubes购自生工生物工程(上海)股份有限公司。实施案例中所用到的毒株具体信息如下：新城疫病毒(NDVNA-1株)其GenBank登录号为DQ659677.1，强毒株，保存于吉林大学动物医学学院动物传染病实验室。新城疫病毒(NDVLaSota株)其GenBank登录号为JF950510.1，弱毒株，保存于吉林大学动物医学学院动物传染病实验室。鸡传染性喉气管炎病毒(IBVH52株)其GenBank登录号为KR605488.1，保存于吉林大学动物医学学院动物传染病实验室。H9N2亚型禽流感病毒其GenBank登录号为AF400788.1,保存于吉林大学动物医学学院动物传染病实验室。鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)其GenBank登录号为KC603937.1，保存于吉林大学动物医学学院动物传染病实验室。实施例1、引物与TaqMan探针的设计与合成根据GenBank中新城疫病本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT‑PCR检测试剂盒,包括引物组和探针组，其特征在于：引物组有引物F和R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1和2的碱基序列；探针组有探针V‑T和L‑T,它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.3和4的碱基序列。
【技术特征摘要】
1.一种新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒,包括引物组和探针组，其特征在于：引
物组有引物F和R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1和2的碱基序列；探针组有探针V-T和L-T,它们
分别具有序列表SEQ.ID.NO.3和4的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述强
毒探针V-T的5＇端标记有报告荧光染料FAM，3＇端标记有淬灭荧光染料BHQ1；弱毒探针L-T的5＇端
标记有报告荧光染料JOE，3＇端标记有淬灭荧光染料BHQ2。
3.根据权利要求1所述的新城疫病毒强、弱毒一步法实时荧光RT-P...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁壮，丛彦龙，尹仁福，王珂，薛聪，钱晶，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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