新城疫病毒HN蛋白119位氨基酸突变体的构建制造技术

本发明专利技术属于蛋白质工程领域，尤其涉及新城疫病毒HN蛋白119位氨基酸突变体的构建。一种新城疫病毒HN蛋白突变体其特征在于该突变体是采用定点突变的方法以新城疫病毒为模板，将HN蛋白糖基化位点第119位氨基酸由AAT被定点突变为CAG，经大肠杆菌感受态细胞HST08株表达，提取阳性质粒，得到新城疫病毒HN蛋白119位氨基酸突变体。研究该突变体有助于研究此处糖基化位点突变对病毒表达、蛋白的空间结构、病毒活性的影响，并可判断病毒的复制性和致病性是否发生改变。

Construction of 119 amino acid mutant of Newcastle disease virus HN protein

The invention belongs to the field of protein engineering, in particular to the construction of 119 amino acid mutants of HN protein of Newcastle disease virus. A Newcastle disease virus HN protein mutants characterized the mutant is a method of using site directed mutagenesis to Newcastle disease virus as template, the HN protein glycosylation sites 119th amino acid from AAT was mutated into CAG, the competent cells of E.coli HST08 strain expression plasmid extraction, Yang, get HN of Newcastle disease virus protein of 119 amino acid mutants. It is helpful to study the effect of glycosylation site mutation on the expression of virus, the structure of protein and the activity of virus, and whether the replication and pathogenicity of virus can be changed.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质工程领域，尤其涉及新城疫病毒HN蛋白119位氨基酸突变体的构建。
技术介绍
体外突变体的构建技术是研究蛋白质结构和功能的有力工具，也是我们在实验室中改造优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是目前蛋白质组研究的重点方向之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或插入，可以改变对应的氨基酸序列，进而影响蛋白质的结构，对突变基因的表达产物进行一系列的研究，有助于了解蛋白质特定区域的功能，探讨蛋白质的结构/结构域。通常采用重叠延伸法、引物法、一步PCR方法等方法，实现对目的基因的定点缺失、插入或碱基替换。因此，体外定点突变技术是基因功能研究的有力工具。蛋白质内部多个位点翻译后的修饰过程在基因功能的调节中发挥重要作用。而基因的点突变体在其结构、功能等研究中发挥非常关键的作用。因此，高效快速准确地构建基因的单个或多个点突变体在基因的功能研究中意义重大。新城疫是由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)引起的一种急性、高度传染性禽类疾病，主要侵害鸡和火鸡，是世界公认的最重要的两大禽类传染病之一。NDV的致病性主要是通过其功能性蛋白-融合蛋白F和血凝素神经氨酸酶蛋白HN共同发挥作用完成的，而糖基化作为一种主要的翻译后修饰作用对蛋白质的功能有着重要影响。所以糖基化位点的突变能够影响病毒蛋白的合成，进而影响其活性和功能。过去的研究往往集中在F蛋白的糖基化位点，而忽视掉HN蛋白的糖基化位点在识别唾液酸受体、促进细胞融合等过程发挥的重要作用,因此研究HN蛋白的糖基化位点，研究糖基化位点突变对病毒表达、蛋白的空间结构、病毒活性的影响以及病毒的复制性和致病性是否发生改变具有显著的意义。
技术实现思路
为克服现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种新城疫病毒HN蛋白119位氨基酸突变体，研究该突变体有助于研究此处糖基化位点突变对病毒表达、蛋白的空间结构、病毒活性的影响，并可判断病毒的复制性和致病性是否发生改变。本专利技术还提供了上述新城疫病毒HN蛋白119位氨基酸突变体的构建方法，该构建方法技术要求高。一种新城疫病毒HN蛋白突变体，该突变体是采用定点突变的方法以新城疫病毒的cDNA为模板，将该新城疫病毒的HN蛋白糖基化位点第119位氨基酸由AAT被定点突变为CAG,经大肠杆菌感受态细胞HST08株表达，提取阳性质粒，验证正确后得到新城疫病毒HN蛋白119位氨基酸突变体。上述突变体的构建主要包括以下步骤：（1）对新城疫病毒的HN蛋白糖基化位点进行定点改造以新城疫病毒的cDNA为模板，用两对特异性引物进行PCR扩增，得到两组扩增产物，分别对两组PCR产物进行电泳切胶回收目的基因片段NDV-1InsertA和NDV-1InsertB；（2）对构建的含有HN蛋白糖基化位点的质粒pVAX用限制性内切酶Sse8387Ⅰ进行酶切后，对酶切产物进行纯化，得到pVAX-NDV-Sse8387Ⅰ；（3）对步骤（2）得到的pVAX-Sse8387Ⅰ用限制性内切酶SfiⅠ进行酶切后，得到pVAX-SfiⅠ/Sse8387Ⅰ,对pVAX-SfiⅠ/Sse8387Ⅰ进行电泳切胶后得到NDV-Vector；（4）将步骤（1）得到的NDV-1InsertA和NDV-1InsertB与步骤（3）得到的NDV-Vector进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌HST08感受态细胞中，将转化细胞涂布于平板上，提取质粒鉴定，筛选阳性菌株，命名为NDV-1-5，即为新城疫病毒HN蛋白119位氨基酸突变体。进一步的，步骤（1）所述的基因片段NDV-1InsertA所用的特异性引物的核苷酸为：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；步骤（1）所述的基因片段NDV-1InsertB所用的特异性引物的核苷酸为：SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。进一步的，步骤（1）所述的PCR反应的反应条件为：98℃10sec，55℃15sec，72℃120sec，共30个循环；然后72℃10min。进一步的，步骤（2）所述的酶切反应条件为：37℃反应2小时；步骤（3）所述的酶切反应条件为：50℃反应4小时；步骤（4）所述的连接反应的条件为50℃反应15min。有益效果（1）本研究在已构建了新城疫病毒HN蛋白糖基化位点119位氨基酸的单点突变体，即将第355-357bp的AAT碱基突变为CAG。获得的糖基化位点单点突变的NDV感染性克隆体有助于研究此处糖基化位点突变对病毒表达、蛋白的空间结构、病毒活性的影响，并可判断病毒的复制性和致病性是否发生改变。（2）本专利技术的突变体构建并拯救成功之后，可明确HN蛋白119糖基化位点突变对病毒复感染能力的影响。在构建的突变体感染性克隆HN119并成功拯救病毒的基础上，通过TCID50测定病毒的感染力变化。结果显示表明，前三代的拯救病毒增殖缓慢，自第四代起病毒增殖加快，第五六代病毒毒价基本稳定一致。突变体病毒的毒价明显低于未突变体病毒；所以，HN119糖基化位点突变后可降低病毒的感染能力，由此判断，119位氨基酸糖基化位点在病毒的致病力方面发挥作用。（3）用探针实时荧光定量PCR方法对突变体病毒和原病毒进行细胞中病毒复制的定量检测，突变体病毒与亲本病毒相比有差异，病毒载量增大。由此检测结果表明，HN119糖基化位点突变后能增强病毒的体外复制能力。附图说明图1新城疫病毒PCR扩增产物电泳图；图2pVAX-SfiⅠ/Sse8387Ⅰ电泳图。具体实施方式结合实施例对本专利技术作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。实施例11.新城疫病毒基因全长的克隆（1）新城疫病毒全长克隆引物的设计扩增引物序列如下表1：表1（2）新城疫病毒全长PCR扩增以新城疫病毒的cDNA为模板，利用上述两对引物对和PrimerSTAR®HS(Premix)高保真酶进行PCR扩增。反应体系如下：组分反应体积NDVcDNA（10ng/ul）1ulPrimer*1（20pmol/ul）0.5ulPrimer*2（20pmol/ul）0.5ulPrimerSTARHS(Premix)25uldH2OUpto50ul反应条件为：98℃10sec，55℃15sec，72℃120sec，共30个循环；然后72℃10min。2.PCR产物电泳与切胶回收取步骤1得到的PCR产物5ul进行1%进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，见附图1。其中扩增片段1长度约500bp、2扩增片段长度约2000bp左右，以上均与预期扩增长度相符。使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0进行切胶回收，扩增引物分别对应的扩增产物和切胶后回收产物的命名如下表2所示：表23.质粒pVAX的酶切与产物回收将质粒pVAX分别进行Sse8387Ⅰ和SfiⅠ酶切，Sse8387Ⅰ和SfiⅠ酶分别购自大连TakaRA公司，Sse8387Ⅰ酶切体系如下：组分反应体积pVAX（50ng/ul）30ul10×QuickCutBuffer5ulSse8387Ⅰ（10U/ul）2uldH2OUpto50ul反应条件为37℃酶切2小时，反应结束后，酶切产物经TaKaRaMiniBESTDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新城疫病毒HN蛋白突变体，其特征在于以新城疫病毒的cDNA为模板，将该新城疫病毒的HN蛋白糖基化位点第119位氨基酸由AAT被定点突变为CAG，经大肠杆菌感受态细胞HST08株表达，提取阳性质粒，验证正确后得到新城疫病毒HN蛋白119位氨基酸突变体。

【技术特征摘要】
1.一种新城疫病毒HN蛋白突变体，其特征在于以新城疫病毒的cDNA为模板，将该新城疫病毒的HN蛋白糖基化位点第119位氨基酸由AAT被定点突变为CAG，经大肠杆菌感受态细胞HST08株表达，提取阳性质粒，验证正确后得到新城疫病毒HN蛋白119位氨基酸突变体。2.一种权利要求1所述的新城疫病毒HN蛋白突变体，其特征在于，所述突变体的构建主要包括以下步骤：（1）对新城疫病毒的HN蛋白糖基化位点进行定点改造以新城疫病毒的cDNA为模板，用两对特异性引物进行PCR扩增，得到两组扩增产物，分别对两组PCR产物进行电泳切胶回收目的基因片段NDV-1InsertA和NDV-1InsertB；（2）对构建的含有HN蛋白糖基化位点的质粒pVAX用限制性内切酶Sse8387Ⅰ进行酶切后，对酶切产物进行纯化，得到pVAX-Sse8387Ⅰ；（3）对步骤（2）得到的pVAX-Sse8387Ⅰ用限制性内切酶SfiⅠ进行酶切后，得到pVAX-SfiⅠ/Sse8387Ⅰ，对pVAX-SfiⅠ/Sse8387Ⅰ进行电泳切胶后得到NDV-Vector；（4...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁小远，王友令，张玉霞，杨金兴，金维江，于可响，宋敏训，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37