一种检测兔出血症病毒的引物及核酸检测方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，涉及一种生物检测技术，具体涉及一种检测兔出血症病毒的特异性引物和MFIA xTAG检测方法。本发明专利技术所述检测RHDV的特异性引物，是根据RHDV的VP60基因序列设计的特异性引物，并基于该特异性引物的性质，本发明专利技术进一步优化建立了适宜于快速准确进行RHDV检测的液相芯片检测方法。与传统检测方法相比，本发明专利技术采用RT‑PCR结合液相芯片检测的方法，检测样本用量少，最低检出病毒量为0.1LD

【技术实现步骤摘要】
一种检测兔出血症病毒的引物及核酸检测方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种生物检测技术，具体涉及一种检测兔出血症病毒的特异性引物和MFIAxTAG检测方法。
技术介绍
兔出血症，又称兔瘟、兔病毒性出血性肺炎、兔出血性肺炎、或兔病毒性败血症，是由兔病毒性出血症病毒(rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV)引起的兔的烈性传染病，以传染性极强、实质脏器淤血、出血，发病率和死亡率极高为特征。兔出血症仅发生于兔之间，以3月龄以上的兔最易感，常呈暴发性流行，对家兔饲养行业造成毁灭性的损失。RHDV属杯状病毒科兔病毒属成员，与欧洲野兔综合征病毒有亲缘关系，但抗原性不交叉。RHDV病毒感染的检测是检测兔出血症的关键指标。但是研究表明，RHDV的体外培养十分困难，因此迄今为止兔出血症的诊断还没有一种理想的方法。目前，RHDV的常规检测方法有血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、间接血凝试验(IHA)、琼脂扩散试验(AGP)、酶标抗体技术、RT-PCR等多种。但这些方法普遍存在特异性差、耗时长、灵敏度低、易出现假阳性等问题，致使病原诊断始终是个难题，所以寻找一种快速准确的诊断RHDV病毒感染的方法显得尤为重要。RT-PCR技术是目前生物
的常用技术手段，具有特异性强、敏感度高的优点，但结果判定需要依靠电泳测定，不仅费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性结果。而荧光定量RT-PCR技术则融合了PCR的多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量检测，检测结果不需要依靠电泳检测，并且整个过程完全是闭管式操作，反应的污染机率降低，也避免了常规PCR检测容易造成的假阳性结果的问题。相对于常规RT-PCR技术，荧光定量RT-PCR技术在检测敏感性、特异性与检测速度等方面均具有明显的优势。荧光免疫分析(MFIA)技术则是结合了流体力学、光学和数字信号处理的一种微球(微珠)生物学技术，其可以实现对单一样品的高通量多重检测。荧光免疫分析技术可以在3小时内完成多达500项指标的检测，是多重生物检测的一项重大进展。其技术原理是采用不同配比的两种红色分类荧光染料将直径为5.6微米的聚苯乙烯微球染成不同的荧光色，从而获得多达100种荧光编码的微球。把针对不同待测物的抗体分子或者基因探针以共价交联的方式结合到特定的编码微球上，每个编码微球都对应相应的检测项目。先把针对不同待测物的荧光编码微球混合，然后加入待测物质或者待测的扩增片段，所形成的复合物再与标记荧光素发生结合反应。微球在流动鞘液的带动下单列依次通过红绿激光，红色激光用来判定微球的荧光编码，绿色激光用来测定微球上报告分子的荧光强度，从而达到快速准确的定量检测目的。而MFIA的xTAG技术是使用Luminex专有的通用标签，通过标签序列与反标签序列的专一性互补配对，进行核酸实验优化、产品开发和分子诊断化验。xTAG技术能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。因此，能否利用MFIAxTAG技术进行RHDV病毒感染状态的检测，成为了兔出血症诊断的发展方向。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种用于检测兔出血症病毒的特异性引物；本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种利用MFIAxTAG技术检测兔出血症病毒的方法，该方法具有快速、准确、敏感性高、特异性好、成本低的优势，完全能够满足快速检测RHDV感染的需要。为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种检测RHDV的特异性引物，所述引物对应的特异性扩增片段位于RHDVVP60基因的第212-585位点之间，大小为374bp。所述特异性扩增片段的序列结构具体为：5’-ACTTCTACTACAATGATGTTTTCACTTGGTCAGTCGCGGACGCACCCGGCAGCATTCTCTACACTGTCCAACACTCTCCACAGAACAACCCATTCACAGCTGTACTGAGCCAGATGTACGCTGGCTGGGCTGGTGGCATGCAGTTCCGCTTCATAGTTGCTGGATCAGGTGTGTTTGGTGGGCGACTGGTCGCGGCTGTGATACCACCAGGCATCGAGATTGGGCCAGGGTTGGAGGTCAGGCAATTTCCTCATGTTGTTATCGACGCCCGTTCACTCGAACCTGTTACCATCACCATGCCAGACTTGCGTCCCAACATGTACCATCCAACTGGTGACCCTGGCCTTGTCCCCACACTAGTCCTTAGTGTTTAC-3’。进一步的，所述引物包括上游引物F和下游引物R；所述上游引物F的5’端含有tag序列，即，tag：5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-3’，所述tag序列与上游引物5’端之间设有间隔臂序列；所述下游引物R的5’端带Biotin标记。3、根据权利要求1或2所述的检测RHDV的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：上游引物F：5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-spacer-ACTTCTACTACAATgATg-3’；下游引物R：5’-Biotin-gTAAACACTAAggACTAg-3’。本专利技术还提供了一种利用MFIAxTAG检测RHDV的核酸检测方法，包括如下步骤：(1)利用常规技术从待测病毒样品中提取病毒RNA；(2)以提取的RNA为模板，以所述的引物进行一步法RT-PCR扩增；(3)将步骤(2)得到的扩增产物，以及磁珠微球和SA-PE进行杂交处理；(4)待杂交反应结束后，利用Luminex200仪器进行分析，即可。所述步骤(3)中，所述微球为包被有特异的anti-tag序列的磁珠微球，所述anti-tag序列能相应地与权利要求1中所选tag序列互补配对。所述步骤(3)中，所述杂交反应体系为：100μL反应体系中，含20μL所述磁珠，75μLSA-PE，5μL扩增产物。所述步骤(3)中，所述杂交反应程序为在37℃反应30min。所述步骤(1)中，所述RT-PCR反应体系：2μLRTBuffer(5×)；1.5μLPCRBuffer(10×)；200μmol/LdNTP混合物；3.5mmol/LMgCl2；0.5μLRNA酶抑制剂；权利要求1所述引物中，上下游引物各10pmoL；5UM-MLV反转录酶；1.5UTaqDNA聚合酶；5μLRNA模板；补ddH2O至25μL。所述步骤(1)中，所述RT-PCR反应的扩增参数为：于42℃处理30min，95℃处理10min，然后95℃处理15s，60℃处理30s，72℃处理15s，共32个循环，最后72℃延伸2min。本专利技术所述检测RHDV的特异性引物，是根据RHDV的VP60基因序列设本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测RHDV的特异性引物，其特征在于，所述引物对应的特异性扩增片段位于RHDV VP60基因的第212-585位点之间，大小为374bp。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测RHDV的特异性引物，其特征在于，所述引物对应的特异性扩增片段位于RHDVVP60基因的第212-585位点之间，大小为374bp。


2.根据权利要求1所述的检测RHDV的特异性引物，其特征在于，所述引物包括上游引物F和下游引物R；
所述上游引物F的5’端含有tag序列，即，
tag：5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-3’，所述tag序列与上游引物5’端之间设有间隔臂序列；
所述下游引物R的5’端带Biotin标记。


3.根据权利要求1或2所述的检测RHDV的特异性引物，其特征在于，所述引物包括：
上游引物F：
5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-spacer-ACTTCTACTACAATgATg-3’；
下游引物R：5’-gTAAACACTAAggACTAg-3’。


4.一种利用MFIAxTAG检测RHDV的核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用常规技术从待测病毒样品中提取病毒RNA；
(2)以提取的RNA为模板，以权利要求1-3任一所述的特异性引物进行一步法RT-PCR扩增；
(3)将步骤(2)得到的扩增产物，以及磁珠微球和SA-PE进行杂交处理；
(4)待杂交反应结束后，利用Luminex200仪器进行分析，即可。


5.根据权利要求4所述的利用MFIAxTAG检测RHDV的核酸检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述微球...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄兵，马秀丽，于可响，刘存霞，姜亦飞，张连芝，庞玉倩，史玉颖，胡峰，宋敏训，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37