用于检测鱼类病毒性神经坏死病荧光定量RT-PCR方法及相应的试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量RT‑PCR方法及相应的试剂盒。本发明专利技术巧妙的应用了特异性的基因检测区分鱼类病毒性神经坏死病与其它种属的菌种或病毒，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明专利技术与现有的主流检测试剂盒相比，本发明专利技术用于检测鱼类病毒性神经坏死病的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测鱼类病毒性神经坏死病荧光定量RT-PCR方法及相应的试剂盒
本专利技术涉及海水鱼类疾病检测，属于分子生物学
，具体涉及一种通过特异性基因对鱼类病毒性神经性坏死病进行荧光定量RT-PCR检测的方法及相应的检测试剂盒。
技术介绍
神经性坏死病毒(Viralnervousvirus,VNNV)属于诺达病毒科，病毒粒子无囊膜，呈20面体状，病毒粒子直径一般为25-34nm，其基因组有两条单链RNA组成，一条RNA编码非结构蛋白，另一条编码主要结构蛋白。患病鱼其病理检查可见脊髓、中枢神经系统及视网膜组织大量形成空泡，出现神经性降解。神经性坏死病流行于除南美洲和非洲外几乎世界所有地区的海水鱼类，广东、福建、海南及台湾地区是我国鱼类神经坏死病的主要高发区，主要感染石斑鱼、红鳍东方鲍及石鲷等鱼的仔鱼和幼鱼，其死亡率一般在40％～100％。重者在一周死亡率可达100％。患有病毒性神经坏死病的鱼，其鱼体发黑，眼球突出，食欲降低，变得消瘦，出现神经机能障碍，病鱼漂游于水面，在水中打圈或者螺旋状游泳等。病理检查可见，病鱼鳔肿大，神经组织坏死，出现空泡。感染鱼类神经性坏死病早期可以通过疫苗控制，但是对于鱼类神经性坏死病毒的流行病学研究有限，所以对其疾病防治效果较差。而在我国，集约化水产养殖盛行，其品种单一、养殖密度高，一旦感染上，疾病传播速度非常快，所以对该病害的检测预防显得格外重要。目前对鱼类神经性坏死病毒检测，主要是基于病理切片法、免疫学、RT-PCR及LAMP技术等各种诊断方法。但是现有的方法都存在不足，基于病理切片法和免疫学检测方法操作复杂、耗时长以及灵敏度低；RT-PCR方法灵敏、准确，但是过程复杂，需要专业人员操作，不适合推广应用；LAMP技术方法快速、简单，但是扩增产物易交叉污染，导致假阳性高，一般只用做疾病初筛，在检测应用中存在一定的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量RT-PCR方法，所述方法能够定量、快速、实时检测鱼类神经性坏死病，使VNNV的检测更准确、灵敏、快速和安全。具体地，上述方法包括如下步骤：S1、收集样品；S2、提取基因组DNA；S3、利用荧光定量RT-PCR检测鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因；S4、读取扩增Ct值；当所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的Ct值小于35时，鱼类病毒性神经坏死病的检测结果为阳性；当所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的Ct值大于35时，鱼类病毒性神经坏死病的检测结果为阴性。作为一种优选技术方案，所述步骤S2中还包括设计CP基因的检测引物和TaqMan探针的步骤。作为一种优选技术方案，所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的检测引物如SEQIDNO:1～2所示；SEQIDNO:1(5'-GGACCTCGTCGGGAAAGGAG-3')；SEQIDNO:2(5'-GACACAGCACTGACACGTTGA-3')。探针序列如SEQIDNO:3所示；SEQIDNO:3(5'-FAM-CGTCACCTGGTCGGCTGATACTCCTGTA-BHQ1-3)。作为一种优选技术方案，所述荧光定量PCR检测的反应体系为25μl，包括2×TaqPCRMix12.5μl，total10uMPrimersMix1μl，TaqMan探针0.5μl，DNAinput2μl，H2O9μl。作为一种优选技术方案，所述荧光定量PCR检测的反应条件为50℃预变性15min，95℃变性10min，94℃退火15s，58℃退火40s，采集荧光信号，40个循环。本专利技术另一目的是提供一种用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量RT-PCR试剂盒，包含所述的鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的检测引物和TaqMan引物探针。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术通过前期对鱼类病毒性神经坏死病和其他种属的菌种和病毒的大量研究数据中，挖掘出能够区分鱼类病毒性神经坏死病和其他种属的菌种和病毒特异性的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出其他菌种或病毒阳性样品和环境样品中是否含有鱼类病毒性神经坏死病，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。(2)本专利技术中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于CP基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。(3)本专利技术检测方法与市面上其他的检测方法相比，本专利技术的检测策略，能够直观的判断鱼类病毒性神经坏死病的感染和其他病毒或菌种感染，结果更加严谨和准确。(4)本专利技术能够实现从101倍稀释到105倍稀释的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。(5)本专利技术检测方法能够应用于养殖水体样本或石斑鱼样品等多方面来源样品筛查和检测，精准地判断出该养殖水体样品中是否含有鱼类病毒性神经坏死病，操作方便、快速、灵敏。本专利技术检测试剂盒能够应用于多种养殖样品的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在养殖水体检测和日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。附图说明图1CP基因检测引物标准曲线。图2是实施例1中CP基因扩增曲线。图3是实施例2中CP基因扩增曲线。图4是实施例3中特异性实验CP基因的扩增曲线。图5是实施例4中不同稀释倍数下样品1的CP基因的扩增曲线。图6为实施例4中不同稀释倍数下样品2的CP基因的扩增曲线。图7为实施例4中不同稀释倍数下样品3的CP基因的扩增曲线。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本专利技术所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。表1在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到检测引物的扩增效率，本专利技术所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出鱼类病毒性神经坏死病感染的样本和其他种属菌类以及病毒感染的样本，从而准确检测并判断出鱼类病毒性神经坏死病。在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个、10000以及10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、收集样品；/nS2、提取基因组DNA；/nS3、利用荧光定量RT-PCR检测鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因；/nS4、读取扩增Ct值；当所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的Ct值小于35时，鱼类病毒性神经坏死病的检测结果为阳性；当所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的Ct值大于35时，鱼类病毒性神经坏死病的检测结果为阴性。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、利用荧光定量RT-PCR检测鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因；
S4、读取扩增Ct值；当所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的Ct值小于35时，鱼类病毒性神经坏死病的检测结果为阳性；当所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的Ct值大于35时，鱼类病毒性神经坏死病的检测结果为阴性。


2.根据权利要求1所述的用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述步骤S2中还包括设计CP基因的检测引物和TaqMan探针的步骤。


3.根据权利要求1所述的用于检测鱼类病毒性神经坏死病的荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述鱼类病毒性神经坏死病特异性基因CP基因的检测引物如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐伟，束文圣，杨荣，束浩然，黄斌，蒋华，
申请(专利权)人：广东美格基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44