一种检测病原微生物的探针设计方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种检测病原微生物的探针设计方法和装置，属于微生物检测技术领域。本发明专利技术设计探针的方法，利用高效筛选算法，可以方便、快速地完成探针设计，不仅适用于食源性致病寄生虫，还适用于其他病原的探针设计。本发明专利技术针对食源性致病寄生虫的探针，特异性强、灵敏度高，稳定性好，并且方便、快速，尤其适用于寄生虫载量低的样本检测，为感染诊疗和食品安全检测提供更好的技术支持。安全检测提供更好的技术支持。安全检测提供更好的技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种检测病原微生物的探针设计方法和装置
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本专利技术属于申请日为2021.01.05，申请号为202110008380.3，专利技术名称为“一种检测4种食源性致病寄生虫的探针、芯片、试剂盒及方法”的中国专利技术专利申请的分案申请，其全部内容通过引用合并于此。


[0003]本专利技术属于微生物检测
，具体地，涉及一种检测病原微生物的探针设计方法和装置。

技术介绍

[0004]食源性致病寄生虫病是当今世界上最关注的公共卫生问题之一，是由寄生虫通过多种途径污染食品和饮水后，因生食或半生食含有感染期寄生虫的食物和水进入人体，引起人的食源性致病寄生虫病的发生。近年来，食源性致病寄生虫病已成为新“富贵病”，特别是沿海经济发达地区的城镇居民的感染人数呈上升势头，且我国食源性致病寄生虫病具有分布广、对人畜危害严重等特点。
[0005]食源性致病寄生虫主要包括吸虫、绦虫、弓形虫和旋毛虫和孢子虫等。传统的食源性致病寄生虫的检测技术有染色涂片检查、漂浮集卵法、沉淀集卵法、麦氏计数法和影像学等，传统的方法操作复杂、周期过长、阳性率低等局限，不能满足食品安全快速检测的需求，也不利于食源性致病寄生虫感染等事件的处理。而近年来发展了一系列病原体核酸分子检测技术，包括PCR、基因芯片、高通量测序基因检测等。PCR具有较好的特异性及灵敏度，但每次只能检测一种致病菌，存在通量低的缺陷，而二代测序技术虽然检测的病原范围大，但周期较长(24h以上)、灵活度低、成本高、整个过程比较复杂，尤其是数据的解读，目前仍然存在一定的困难。而基因芯片既具备高灵敏性和特异性，且成本较低、操作灵活、时效性高、针对性强，使得其十分适用于对特定类型样本的病原检测，适合临床和食品安全检测的应用。
[0006]基因芯片(GeneChip)又称为微阵列技术(MicroArray)，主要包括5个技术环节：探针构建、芯片制备、样品制备、芯片实验、信号检测及结果判读。基因芯片上的探针设计是体现芯片检测效能的核心因素之一，然后现有的特异性探针序列设计算法均从微生物的保守基因如细菌的16SrRNA、真菌的ITS等进行挖掘，且采用长序列比对的方式，故算法程序缺乏足够的灵活性，且探针序列缺乏足够的覆盖度和灵敏性。不能满足大规模的寄生虫检测基因芯片的设计要求。此外，现有的芯片设计方法未考虑微阵列上荧光信号的区域不均匀性而对各类探针的排布进行设计，现有的芯片设计方法缺乏荧光信号的标准化处理。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题中的至少一个，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术第一方面提供一种检测4种食源性致病寄生虫中一种或多种的探针组合，其中，所述4种食源性致病寄生虫为广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫。
[0009]广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)是引起广州管圆线虫病(食源性寄生虫病)的病原体，其成虫寄生于鼠的肺动脉内，人是该虫的非正常宿主。人因生食或半生食含有该寄生虫幼虫的褐云玛瑙螺、福寿螺、蜗牛或蔬菜而感染该虫幼体，感染人体后其幼虫移行至机体中枢神经系统，并引发嗜酸性脑炎和脑膜脑炎，其症状常表现为剧烈头痛、恶心、喷射性呕吐和颈项强直等神经系统症状。该病在热带和亚热带地区流行，在我国呈散在分布，多发生于沿海地区。
[0010]微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是一种呈全球性分布的重要食源性/水源性人兽共患的机会性致病，专性胞内寄生虫，感染后寄生于哺乳动物和人体小肠中，是重要的腹泻病原之一，该虫体感染引起的隐孢子虫病多见于免疫功能低下或免疫缺陷人群，表现为急慢性腹泻，并伴有发热、恶心、咳嗽及呼吸困难等症状。
[0011]刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)也称为三尸虫，是一种专性胞内寄生虫，其终宿主是猫科动物。人体常因接触或食用被污染的水与食物而感染，虫体可随血液流动，到达大脑、心脏和眼底等部位，引起弓形虫病。免疫力正常者多数无明显症状，但当机体免疫力低下或免疫缺陷时可因散播性感染致死。此外，孕妇感染弓形虫可导致流产、死胎或畸形胎。
[0012]猪肉绦虫(Taenia solium)是中国主要的人体寄生绦虫，其终宿主是人。人体感染的发生常因误食生的或未煮熟的含猪肉绦虫幼虫
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囊尾蚴的猪肉。囊尾蚴的寄生部位很广，包括皮下组织、中枢神经系统、眼部、肝和肺等部位，引起的病症主要是皮下及肌肉囊尾蚴病、眼囊尾蚴病和脑囊尾蚴病。
[0013]在本专利技术的一些实施方案中，所述探针组合包括能够检测广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫中至少两种食源性致病寄生虫的探针。
[0014]在本专利技术的一些优选实施方案中，所述探针组合包括能够检测广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫中至少三种食源性致病寄生虫的探针。
[0015]在本专利技术的一些更优选实施方案中，所述探针组合包括能够检测广州管圆线虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和猪肉绦虫四种食源性致病寄生虫的探针。
[0016]在本专利技术中，所述探针组合也称为探针组合物，是指有多种探针组成的组合物。
[0017]在本专利技术的一些实施方案中，检测广州管圆线虫的探针包括分别具有SEQ ID No.1～6所示核苷酸序列的探针中的至少一种；检测微小隐孢子虫的探针包括分别具有SEQ ID No.7～12所示核苷酸序列的探针中的至少一种；检测刚地弓形虫的探针包括分别具有SEQ ID No.13～18所示核苷酸序列的探针中的至少一种；检测猪肉绦虫的探针包括分别具有SEQ ID No.19～24所示核苷酸序列的探针中的至少一种。
[0018]在本专利技术的一些具体实施方案中，检测广州管圆线虫的探针包括分别具有SEQ ID No.1～6所示核苷酸序列的探针；检测微小隐孢子虫的探针包括分别具有SEQ ID No.7～12所示核苷酸序列的探针；检测刚地弓形虫的探针包括分别具有SEQ ID No.13～18所示核苷酸序列的探针；检测猪肉绦虫的探针包括分别具有SEQ ID No.19～24所示核苷酸序列的探针。
[0019]在本专利技术中，针对特定食源性致病寄生虫的探针是利用以下方法设计得到的：
[0020]S1，获得所述食源性致病寄生虫的参考基因组序列；
[0021]S2，将获得的参考基因组序列打断成50nt k
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mer集，首先将k
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mer集比对到人参考参考基因组序列hg19，过滤identity大于等于85的k
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mer；然后所述食源性致病寄生虫的k
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mer集与其他食源性致病寄生虫利用同样方法打断的50nt k
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mer集进行两两比较，过滤连续比对碱基数大于20nt的探针，筛选出所述食源性致病寄生虫的初始特异性探针序列集，并统计探针序列丰度；
[0022]S3，对初始特异性探针序列集进行过滤：
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测病原微生物的探针设计方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，获得所述病原微生物的参考基因组序列；S2，将获得的参考基因组序列打断成50nt k
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mer集，首先将k
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mer集比对到人参考参考基因组序列hg19，过滤identity大于等于85的k
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mer；然后将所述病原微生物的k
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mer集与其他病原微生物利用同样方法打断的50nt k
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mer集进行两两比较，过滤连续比对碱基数大于20nt的探针，筛选出所述病原微生物的初始特异性探针序列集，并统计探针序列丰度；S3，对初始特异性探针序列集进行过滤：S31，将所述初始特异性探针序列集中的探针序列与其他病原微生物的RefSeq核酸数据库进行序列比对，如比对长度大于20nt以上，则计算探针序列与目标序列的核酸自由能，如核酸自由能小于
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30，则去除该探针序列；S32，若探针的连续相同碱基出现5次，则去除该探针序列；S4，从剩余的探针序列中保留丰度最高的前N条探针序列作为所述病原微生物的探针序列，优选地，所述N＝1～50。2.根据权利要求1所述的检测病原微生物的探针设计方法，其特征在于，所述病原微生物选自细菌、病毒、真菌和寄生虫中的至少一种。3.根据权利要求1所述的检测病原微生物的探针设计方法，其特征在于，同时设计多种病原微生物的探针，在步骤S1中，获得多种病原微生物的参考基因组。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，针对一种病原微生物设计探针时，将所述多种病原微生物中的其他病原微生物的参考基因组序列打断成18nt k
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mer集，在步骤S2后、步骤S3前，将获得的探针分别与18ntk
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【专利技术属性】
技术研发人员：林德春，金桃，张智闵，詹太平，蒋华，
申请(专利权)人：广东美格基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：