一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法技术

本发明专利技术属于禽病预防疫苗制备技术领域，具体涉及一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法的专利申请。该方法包括制备新城疫病毒样颗粒、制备GM‑CSF‑GPI锚定蛋白、嵌合型新城疫病毒样颗粒组装等步骤。利用本发明专利技术所制备的嵌合型新城疫病毒样颗粒，其基于蛋白水平的修饰策略，可避免基因水平转染不稳定的缺陷，并且嵌合的蛋白可被准确定量；同时，该嵌合型新城疫病毒样颗粒可作为新型灭活疫苗应用，在免疫鸡后可诱导机体产生特异性免疫反应，有效提高免疫应答，因而具有广阔的应用前景。

Preparation method of chimeric Newcastle disease virus like granule

The invention belongs to the technical field of poultry disease prevention vaccine preparation, in particular to a method for preparing chimeric Newcastle disease virus like particles of the patent application. The method includes preparing a Newcastle disease virus like particles, preparation of GM CSF GPI anchoring protein, chimeric Newcastle disease virus like particle assembly steps. Using the prepared chimeric Newcastle disease virus like particles, the modified strategy based on protein level, can avoid the defects of unstable gene transfection, and the chimeric protein can be accurately quantified; at the same time, the chimeric Newcastle disease virus like particles can be used as a new type of inactivated vaccine in chicken application. It can induce specific immune response, effectively improve the immune response, so it has wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于禽病预防疫苗制备
，具体涉及一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法的专利申请。
技术介绍
新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽类为主的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，被OIE列为必报动物疫病，也是我国中长期规划五大优先防治的动物疫病之一。新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）在病毒学分类中属于副黏病毒科、禽副黏病毒属的一个种，即禽副黏病毒1型，是一种不分节段的单分子负链RNA病毒。新城疫病毒基因组结构模式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein，NP）、磷蛋白（Phosphorprotein，P）、基质蛋白（Matrixprotein，M）、融合蛋白（Fusionprotein，F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidaseprotein，HN）和大分子蛋白（Largeprotein，L）。新城疫病毒颗粒为有囊膜的病毒粒子，呈多形性，直径约为120nm~300nm，囊膜表面覆盖有8nm长的纤突，病毒粒子内部为一直径17nm左右的卷曲核衣壳。基质蛋白M位于囊膜和核衣壳之间，既与膜结合又与核衣壳结合，是新城疫病毒粒子形成和出芽的主要驱动力。鸡新城疫自1946年在我国首次报道至今，已在中国存在60多年，表现出一定新的临床及流行特点。流行病学数据充分证明基因VII型已经成为我国NDV流行的主要优势基因型，但也存在基因III、IX和VI型等散发，基因VII型NDV所占的比重呈逐年上升趋势。与此同时，NDV经过世界范围内四次大流行后，其宿主范围也不断扩大，迄今能自然或人工感染的禽类已超过250多种。过去认为，NDV一般不对鸭、鹅等水禽有致病性，而近十几年，在鸭群、鹅群中常见新城疫的暴发与流行。大量流行病学调查数据显示，当前我国NDV的优势流行株属于基因VII型，而目前国内普遍使用的疫苗LaSota为基因II型，虽然它们同属一个血清型，但在遗传距离上相差较远，对当前NDV强株的攻击并不能提供理想的免疫保护效力。目前常用的生产活疫苗的毒株有Mukteswar株（I系苗）、HitchnerB1株（II系苗）、F株（III系苗）、LaSota株（IV系苗）以及V4弱毒苗。其中I系苗为中等毒力型，II、III、IV系疫苗毒力较弱。弱毒苗可大规模饮水、喷雾和气雾免疫，能刺激黏膜免疫，而且疫苗毒可以从免疫禽传播给未免疫禽。其不足之处在于污染环境，并且有毒力返强可能，在机体抵抗力下降时，可能引起发病。生产灭活苗的毒种一般包括LaSota、Ulster等，实际生产中多用来制造二联或多联疫苗。灭活苗产生抗体水平较高，持续时间较长，比较容易储存，受母源抗体影响小，免疫不良反应小；但灭活苗的灭活、乳化及免疫时需要较大剂量，所以成本较高。鉴于新城疫的流行对我国整个养禽业造成了巨大的经济损失，加紧研制有效疫苗十分有必要。病毒样颗粒（Virus-likeparticles，VLPs）是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能，安全性高，在形态上与天然病毒颗粒相似，能够通过与病毒感染一样的途径，以接近真实构象的形式递呈给免疫细胞，更容易被机体免疫系统识别，从而有效诱导机体产生免疫保护反应。病毒样颗粒的制备可基于大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞以及昆虫杆状病毒这四种表达系统，而利用昆虫杆状病毒表达系统制备的病毒样颗粒种类已占到了30%以上，其主要原因是该系统具有不同于其他表达系统的独特优点：（1）承载量大，杆状病毒可容纳较大的外源DNA插入(约l0kb)而不影响病毒的复制与装配；(2)高效表达，多角体基因和p10基因有非常强大的启动子能驱动靶基因的高水平表达，外源基因表达量往往是其他系统的几十到几百倍；(3)表达产物后加工较完善，昆虫细胞对蛋白质的后加工系统与哺乳动物细胞接近，具有表达产物能糖基化、磷酸化、脂肪酞化、酞胺化、切割信号肤和形成三级或四级高级结构的特点，所以在结构、生物活性、抗原性和免疫性等方面与天然蛋白有很高的相似性；(4)借助多元表达载体或借助几个不同重组病毒的共感染，可以同时表达两个或多个外源蛋白，便于研究肽链的装配和蛋白寡聚体的结构和功能；(5)适合表达细胞毒性蛋白，应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使表达产物是细胞毒性蛋白，也不影响表达水平，因为在这些有毒产物表达之前，病毒已经完成复制并释放出大量成熟的子代毒粒，不会干扰病毒的复制；(6)安全性好，杆状病毒是昆虫或者节肢动物病毒，对人畜无害，外源基因插入多角体蛋白基因位点引起其缺失或失活，因此重组病毒不能产生包涵体，这不仅为重组病毒提供了选择标记，而且重组病毒无多角体蛋白形成，失去了病毒粒子的天然护物一多角体蛋白结晶体，极易在自然环境中失活，不能像野生病毒那样在环境中长期存在，在自然界生存能力弱，所以更加安全；(7)杆状病毒表达载体通用性广，能用于表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因。因此，用该系统生产病毒样颗粒容易形成产业化。嵌合病毒样颗粒(chimericVLPs，cVLPs)是一种改良型VLP，通过基因融合表达或以VLP为载体通过化学偶联或基因融合的方法将外源抗原与其偶联制备而成。嵌合型病毒样颗粒在同一细胞中复合基因的共转染及协同表达在许多方面还困难重重，cVLPs的组装程度较低，同时还需要特定的结构蛋白，因此缺点十分明显。GPI锚定蛋白是一种新型真核细胞表面蛋白，它只通过GPI结构锚定于真核细胞膜表面而不跨越其磷脂膜双层结构。与传统跨膜型细胞表面蛋白不同，它只通过其梭基末端的GPI结构锚定于细胞膜表面，并不跨越其磷脂膜双层结构。GPI锚定蛋白转染法是指将目的蛋白编码序列和GPI锚定信号肽编码序列重组，制备该目的蛋白的GPI重组衍生物，当它在适宜的温度下与靶细胞共同孵育时，可自动整合至真核细胞膜表面并表达活性。其优点在于:①许多原始细胞，无论正常细胞或肿瘤细胞均不易在体外长期生长，且难以稳定转染(病毒性载体除外)，而蛋白转化法则不依赖于细胞自身增殖潜能及可转染性，可以锚定于难于转染的细胞，故可用于原代细胞的转化，与细胞类型无关。②在同一细胞中复合基因的共转染及协同表达在许多方面还困难重重，而蛋白转化原则上可允许无限数量的蛋白同时或顺序地传递至同一细胞，表达于细胞表面的蛋白含量可精确控制。③与基因转化不同，蛋白转化是另一个非常迅速的过程，可以减少细胞的培养时间而迅速改变细胞表面性状，尤其适用于临床治疗。④GPI锚定蛋白可在磷脂酶C的作用下由细胞表面分离，当它被非离子型去污剂由细胞表面洗脱后，可在一定条件下重新整合至细胞表面并恢复其功能，从而克服了传统基因转化法的不足。⑤不同种GPI锚定蛋白可以相继或同时锚定于同一种细胞膜。现有技术中，尚未见到较好的利用GPI锚定蛋白策略来构建新城疫病毒样颗粒的有关报道。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种利用新的制备策略所提供的一种嵌合型新城疫病毒样颗粒制备方法，利用该方法制备的新城疫病毒样颗粒可为相关新型新城疫疫苗的开发奠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）制备新城疫病毒样颗粒，具体为：将新城疫病毒基质基因和血凝素‑神经氨酸酶基因分别克隆至T载体中，分别构建重组克隆质粒pT‑M和pT‑HN；对pT‑M和pFastBac Dual质粒分别进行SalI‑NotI双酶切，将酶切产物进行连接构建重组质粒pFastBac‑M；再将质粒pFastBac‑M和pT‑HN分别进行NheI‑KpnI双酶切，将酶切产物进行连接，最终构建穿梭质粒pFastBac‑M+HN；将所构建的穿梭质粒pFastBac‑M+HN转化DH10 Bac感受态细胞中，获得重组杆粒rBacmid‑M+HN；将重组杆粒rBacmid‑M+HN转染昆虫Sf 9细胞后得到重组杆状病毒rBV‑M+HN，经培育并纯化处理后，得到新城疫病毒样颗粒；（2）制备GM‑CSF‑GPI锚定蛋白，具体为：人工合成如SEQ ID NO.1所示融合序列，将该融合序列与pFastBac1进行连接构建穿梭质粒pFastBac‑GM‑CSF‑GPI；将穿梭质粒pFastBac‑GM‑CSF‑GPI转化至DH10 Bac感受态细胞中，筛选获得重组杆粒rBacmid‑GM‑CSF‑GPI；将重组杆粒rBacmid‑GM‑CSF‑GPI转染昆虫Sf9细胞后得到重组杆状病毒rBV‑GM‑CSF‑GPI，经培育并纯化处理后，得到GM‑CSF‑GPI锚定蛋白；（3）制备嵌合型新城疫病毒样颗粒，具体为：将步骤（1）中制备所得新城疫病毒样颗粒和步骤（2）制备所得GM‑CSF‑GPI锚定蛋白，混合均匀后进行孵育，孵育结束后离心，收集沉淀即为嵌合型新城疫病毒样颗粒。...

【技术特征摘要】
1.一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）制备新城疫病毒样颗粒，具体为：将新城疫病毒基质基因和血凝素-神经氨酸酶基因分别克隆至T载体中，分别构建重组克隆质粒pT-M和pT-HN；对pT-M和pFastBacDual质粒分别进行SalI-NotI双酶切，将酶切产物进行连接构建重组质粒pFastBac-M；再将质粒pFastBac-M和pT-HN分别进行NheI-KpnI双酶切，将酶切产物进行连接，最终构建穿梭质粒pFastBac-M+HN；将所构建的穿梭质粒pFastBac-M+HN转化DH10Bac感受态细胞中，获得重组杆粒rBacmid-M+HN；将重组杆粒rBacmid-M+HN转染昆虫Sf9细胞后得到重组杆状病毒rBV-M+HN，经培育并纯化处理后，得到新城疫病毒样颗粒；（2）制备GM-CSF-GPI锚定蛋白，具体为：人工合成如SEQIDNO.1所示融合序列，将该融合序列与pFastBac1进行连接构建穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI；将穿梭质粒pFastBac-GM-CSF-GPI转化至DH10Bac感受态细胞中，筛选获得重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI；将重组杆粒rBacmid-GM-CSF-GPI转染昆虫Sf9细胞后得到重组杆状病毒rBV-GM-CSF-GPI，经培育并纯化处理后，得到GM-CSF-GPI锚定蛋白；（3）制备嵌合型新城疫病毒样颗粒，具体为：将步骤（1）中制备所得新城疫病毒样颗粒和步骤（2）制备所得GM-CSF-GPI锚定蛋白，混合均匀后进行孵育，孵育结束后离心，收集沉淀即为嵌合型新城疫病毒样颗粒。...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁壮，徐小洪，钱晶，丁佳欣，李金斗，黄蕾，尹仁福，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22