一种嵌合蛋白、病毒样颗粒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种嵌合蛋白、病毒样颗粒及其应用，属于分子生物学领域。所述嵌合蛋白，是选择猪圆环病毒2型 Cap蛋白中如下四个位点中一个、两个或者三个替换为猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白主要B细胞表位后得到：第58-66位氨基酸残基；第72-94位氨基酸残基；第122-147位氨基酸残基；第162-197位氨基酸残基。所述嵌合蛋白，可溶性表达后可以形成嵌合病毒样颗粒，将猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的主要B细胞表位展示到嵌合病毒样颗粒的表面，对PCV2与FMDV均具有很好的免疫原性，一次免疫就能够产生较高的针对PCV2与FMDV的抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及。
技术介绍
猪圆环病毒2型么PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰 竭综合征（PWMS)的主要病原，它不但可以导致断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪A2型先 天性震颤（All，CT)、怀孕母猪流产、成年猪皮炎肾炎综合征（PDNS)和呼吸道疾病综合征 (PRDS)密切相关。自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，在我国 猪群中流行十分严重，给全世界养猪业造成了重大的经济损失。在2010年国际猪兽医大会 (IPVS)上，猪圆环病毒2型感染成为关注度最高的疾病，是全球公认的危害养猪业的重要 传染病之一。近年来，国内猪圆环病毒2型感染呈上升趋势。 猪0型口蹄疫（FMD)是由0型口蹄疫病毒（FMDV)引起的猪的一种急性、热性、高度 接触性传染病。除感染猪外，还可感染牛、羊等偶蹄动物。该病传播迅谏，发病率高，是世界 动物下.牛纟目织（0IE)规定必须报告的传染病之一，中国政府规定为一类动物疫病。该病不 但引起幼畜死亡，生产性能下降，而且严重影响家畜及畜产品流通和贸易活动。口蹄疫危害 牛、猪、羊等偶蹄类动物，以传播迅速，感染率高而著称，国际兽疫局将其列为A类传染病之 首。0型口蹄疫病毒（FMDV)的VP1蛋白表面的GH loop是VP1蛋白也是FMDV的主要抗原 表位，它包含连续性B细胞抗原表位，该表位可诱导机体产生高效价的中和抗体，是研制口 蹄疫表位疫苗的首选靶标。目前市场上既没有商品化的猪圆环病毒2型与0型口蹄疫的二联常规疫苗，也没 有关于两个病的基因工程疫苗。因此，为了预防猪感染上述两种疾病，需要分别接种相应的 疫苗，至少需要接种两次，工作量大，劳动力成本较高，效率低。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种嵌合蛋白，可溶性表达后可以形成嵌合病毒样颗粒，将猪0 型口蹄疫病毒VP1蛋白的主要B细胞表位展示到嵌合病毒样颗粒的表面，对PCV2与FMDV 均具有很好的免疫原性。 本专利技术的另一目的是提供所述嵌合蛋白的编码基因。 本专利技术的再一目的是提供嵌合病毒样颗粒，将猪0型口蹄疫病毒VP1蛋白的主要 B细胞表位展示到病毒样颗粒的表面，对PCV2与FMDV均具有很好的免疫原性。 本专利技术的再一目的是提供猪圆环病毒2型和0型口蹄疫二联疫苗，对PCV2与FMDV 均具有很好的免疫原性，仅对猪接种一次后，就能够同时产生较高的针对PCV2和FMDV的抗 体水平，大大减少了工作量，成本低。 本专利技术的目的采用如下技术方案实现。 本专利技术提供一种嵌合蛋白，是选择猪圆环病毒2型Cap蛋白中如下四个位点中一 个、两个或者三个替换为猪〇型口蹄疫病毒VP1蛋白主要B细胞表位后得到： (1) 第58-66位氨基酸残基； (2) 第72-94位氨基酸残基； (3) 第122-147位氨基酸残基； (4) 第162-197位氨基酸残基。 在本专利技术中，所述猪圆环病毒2型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示； 所述猪〇型口蹄疫病毒VP1蛋白主要B细胞表位的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示。 本专利技术提供所述嵌合蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ IDN0:3-8之一所示。 本专利技术提供含有所述基因的重组载体；优选的技术方案中，所述重组载体是所述 基因插入表达载体所得；所述表达载体优选为PTXB1。 本专利技术还提供含有所述基因的重组菌，是将含有所述基因的重组载体导入宿主菌 中得到的重组菌；所述重组载体是将所述基因插入表达载体PTXB1所得。 本专利技术还提供一种嵌合病毒样颗粒，由所述嵌合蛋白自我组装而成，所述嵌合病 毒样颗粒表面展示有猪〇型口蹄疫病毒VP1蛋白主要B细胞表位。 在本专利技术中，所述嵌合病毒样颗粒采用如下方法制备：诱导所述重组菌表达嵌合 蛋白，裂解重组菌，取裂解液上清，采用硫酸铵沉淀法纯化，获得所述嵌合病毒样颗粒。 本专利技术还提供猪圆环病毒2型和0型口蹄疫病毒二联疫苗，活性成分为所述嵌合 病毒样颗粒。 在本专利技术中，术语"206佐剂"是指法国赛比克（SEPPIC)公司生产的Montanide ISA 206系列的佐剂，包括Montanide ISA 206、ISA 206VG等，该佐剂属于油乳佐剂， 是一类含十八烷酸和无水甘露醇酯的水包油包水型（w/o/V)免疫佐剂。 本专利技术选择猪0型口蹄疫VP1蛋白主要B细胞表位基因（GH loop)采取基因置换 的方式替换PCV2 Cap蛋白编码基因内部的4个loop环(对应于四个位点）中的一个、两个 或三个，使重组嵌合蛋白分子内部含有1个、2个或3个口蹄疫病毒VP1蛋白主要B细胞表 位，即得到本专利技术嵌合蛋白。若干个可溶性表达的嵌合蛋白，能够在体外自我组装成嵌合病 毒样颗粒，将猪〇型口蹄疫病毒VP 1蛋白主要的B细胞表位展示到嵌合病毒样颗粒的表面。 本专利技术所述嵌合病毒样颗粒对PCV2与FMDV均具有很好的免疫原性。本专利技术嵌合病毒样颗 粒的制备方法简单，成本低。 以本专利技术嵌合病毒样颗粒为活性成分的猪圆环病毒2型和0型口蹄疫二联疫苗， 对PCV2与FMDV均具有很好的免疫原性，仅需一次免疫，猪体内就能够产生较高的针对PCV2 与FMDV抗体水平，尤其由PCV2 Cap蛋白中替换插入了两个猪0型口蹄疫病毒VP 1蛋白主要 B细胞表位得到的嵌合蛋白形成的嵌合病毒样颗粒，免疫猪后产生了显著高于商品化PCV2 和FMDV疫苗的抗体水平，取得了意想不到的技术效果。另外，从本专利技术可以发现，当PCV2 Cap蛋白中3个位点同时替换为其他的抗原表位时，仍然能够形成嵌合病毒样颗粒，虽然对 PCV2 Cap蛋白的免疫原性较差，但是对其他的抗原表位具有非常好的免疫原性，因此，PCV2 Cap蛋白可以作为一种高效携带抗原表位的载体。【附图说明】 图1是重组质粒酶切鉴定图，1: Marker ;2_5:重组质粒pTXB-Cap-loopl、 pTXB-Cap-loop2、pTXB-Cap-loop3 与 pTXB-Cap-loop4 双酶切产物。 图2是重组质粒pTXB-Cap-loop2_loop4酶切鉴定图，1 :Marker ;2、3:重组质粒 pTXB-Cap-loop2-loop4 双酶切产物。图 3 是重组质粒 pTXB-Cap-loop2-loop3-loop4 酶切鉴定图，1: Marker ;2、3:重 组质粒 pTXB-Cap-loop2-loop3-loop4 双酶切产物。 图4是嵌合蛋白Cap-loopl可溶性分析结果，1 :marker; 2-4分别为 pTXB-Cap-l〇〇pl/BL21诱导后全菌、诱导后裂解液上清、诱导后裂解液沉淀。 图5是嵌合蛋白Cap_loop2可溶性分析结果，1 :marker ;2_4分别为： pTXB-Cap-l〇〇p2/BL21诱导后全菌、诱导后裂解液上清、诱导后裂解液沉淀；5 :诱导后对照 菌株 PTXB1/BL21。 图6是嵌合蛋白Cap_loop3可溶性分析结果，1 :marker ;2_4分别为： pTXB-Cap-l〇〇p3/BL21诱导后全菌、诱导后裂解液上清、诱导后裂解液沉淀；5 :诱导后对照 菌株 PTXB1/BL21。 图7是嵌合蛋白Cap_loop4可溶性分析结果，1 :mar本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合蛋白，是选择猪圆环病毒2型 Cap蛋白中如下四个位点中一个、两个或者三个替换为猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白主要B细胞表位后得到：（1）第58‑66位氨基酸残基；（2）第72‑94位氨基酸残基；（3）第122‑147位氨基酸残基；第162‑197位氨基酸残基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑其升，李图帅，乔绪稳，陈瑾，赵晓云，于晓明，吴楠，张元鹏，李鹏成，侯立婷，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32