本发明专利技术公开了一种嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于分子生物学和细胞生物学领域。该病毒样颗粒表面展示不同的HCV中和抗原表位，嵌合病毒样颗粒免疫小鼠后可产生HCV中和表位特异性的中和抗体。该方法将HCV中和抗原表位嵌合于HBV S抗原亲水区，不影响其自我包装，从而形成嵌合的病毒样颗粒，表达HCV中和抗原表位。制备得到的四种病毒样颗粒经化后免疫BLAB/c小鼠可诱导产生表位特异性的中和抗体，产生的中和抗体能抑制HCVpp和HCVcc感染Huh7.5细胞。制备的嵌合病毒样颗粒具有保护作用，能够成为一种较理想的HCV预防性/治疗性候选疫苗建立方法。
【技术实现步骤摘要】
嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒及其制备方法 和应用
本专利技术属于分子生物学和细胞生物学领域，涉及一种嵌合HCV中和表位的HBV S 抗原病毒样颗粒及其制备方法和应用。
技术介绍
丙型肝炎病毒（HCV)急性感染后易慢性化和发展成为肝硬化、肝细胞肿瘤或肝功 能衰竭。一直以来丙型肝炎的疫苗研制受到高度变异、缺乏细胞和小动物模型等多种原因 的限制而进展缓慢。HCV病毒中许多蛋白抗原（如核心蛋白、包膜蛋白和非结构蛋白）都 可诱导抗体产生。但在这些抗体中，只有针对包膜糖蛋白E1/E2的中和抗体具有保护作用。 近年来研究发现，HCV包膜糖蛋白E1/E2存在保守的中和性抗原表位，针对这些表位的单克 隆抗体具有广谱的交叉中和活性。以上研究结果使为中和表位疫苗的研究提供了依据。寻 求理想的载体，呈递和表达中和抗原表位，成为HCV中和表位疫苗研究的方法之一。 病毒样颗粒（virus like particles, VLPs)是不含病毒颗粒，形态结构与天然病 毒颗粒相似的能自我装配的病毒空壳。许多病毒结构蛋白都具有自主组装成VLPs的能力。 由于VLPs不含病毒遗传物质，所以不具备感染性，而具有很强的免疫原性和生物学活性， 广泛应用于疫苗研究领域。VLPs在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合体 VLPs并将外源性抗原展示在其表面，保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗 原表位，比亚单位疫苗和重组的蛋白疫苗具有更强的免疫原性，能够激发机体体液免疫、细 胞免疫及粘膜免疫。 HBV小包膜蛋白抗原（HBsAg-S)基因大小为681bp，在无核心蛋白和基因组参与下 有自我装配能力。其101?159位氨基酸区域为亲水区，形成的双环结构可表达外源性表 位蛋白，在哺乳动物细胞中形成与野生型病毒相似的VLPs，可分泌至细胞外。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒及其制备 方法和应用，该病毒样颗粒表面展示不同的HCV中和抗原表位，嵌合病毒样颗粒免疫小鼠 后可产生HCV中和表位特异性的中和抗体。该方法将HCV中和抗原表位嵌合于HBV S抗原 亲水区，不影响其自我包装，从而形成嵌合的病毒样颗粒，表达HCV中和抗原表位。 本专利技术是通过以下技术方案来实现： 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒，该病毒样颗粒是将HCV表位插入HBV S抗原亲水区构建真核表达载体，再经哺乳动物细胞体外装配制得；其中，所述的HCV表位 为氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?4中任意一项所示的表位肽。 氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?3所示的表位为高度保守的中和表位；氨基酸序列 如SEQ. ID. NO. 4所示的表位为高变区的模拟表位。 氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示的表位为HCV El区线性中和表位；氨基酸序列如 SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2所示的表位为HCV E2区线性中和表位；所述高变区的模拟表 位为HCV E2模拟表位。 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒的制备方法， 包括以下步骤： 1)在HBV S基因亲水区引入Age I克隆位点 将引入Age I克隆位点的全长S基因亚克隆至真核表达载体pCI-neo中，得到重 组真核表达载体PCI-HBS ; 2)将HCV表位以引物合成的形式克隆入重组真核表达载体pCI-HBS中 以 pCI-HBS 为模板，分别用 FElAge I/R2Xba I，FE2Age I/R2Xba I，FE3Age 1/ R2Xba I，FE4Age I/R2Xba I为引物，扩增得到引入不同表位的HBV S下游128-227位氨基 酸的碱基序列，扩增产物回收后连接入T-easy载体，分别得到T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3， T-HBSE4 ； 3)构建嵌合HCV中和抗原表位真核载体 将 T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3, T-HBSE4 分别用 Age I/Xba I 双酶切，克隆入 Age I/Xba I双酶切的pCI-HBS中，得到重组的嵌合HCV中和抗原表位的真核表达载体，分别为 pCI-HBSEl，pCI-HBSE2, pCI-HBSE3, pCI-HBSE4 ; 4)病毒样颗粒的制备 分别将 pCI-HBSEl、pCI-HBSE2、pCI-HBSE3 和 pCI-HBSE4 转染哺乳动物细胞，转染 48h后收集培养上清，定量测定HBsAg含量，得到四种不同的嵌合病毒样颗粒VLPs，分别命 名为 VLPs-SEl、VLPs-SE2、VLPs-SE3 和 VLPs-SE4。 步骤2)所述的以引物合成的形式克隆HCV表位所用到的引物F1、R1、F2、R2、FE1、 FE2、FE3和FE4的核苷酸序列分别如SEQ. ID. NO :5?12所示。 步骤4)所述的哺乳动物细胞为HEK293T、Hela或Huh7. 5细胞。 步骤4)采用磷酸钙法或脂质体法转染哺乳动物细胞。 步骤4)是采用罗氏E601电化学发光分析仪对HBsAg含量进行定量测定。 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒在制备用于治疗HCV感染病症的疫苗 中的应用。 所述的疫苗为抑制HCVpp和HCVcc感染Huh7. 5细胞的疫苗。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果： 本专利技术将HCV中和抗原表位嵌合于HBV S抗原亲水区，不影响其自我包装，从而形 成嵌合的病毒样颗粒，表达HCV中和抗原表位。本专利技术制备得到四种HCV中和抗原表位 嵌合病毒样颗粒，能够在小鼠体内诱导出表位特异性中和抗体，血清中和抗体能抑制HCVpp 和HCVcc感染Huh7. 5细胞，嵌合病毒样颗粒表现出了良好的中和效应，具有保护作用。为 进一步设计中和抗体疫苗提供了新的技术方法。 【附图说明】 图1为HCV中和抗原表位嵌合入HBV S抗原亲水区设计图； 图2为嵌合HCV中和抗原表位真核表达载体构建琼脂糖电泳结果图； 图3为嵌合HCV中和抗原表位的HBV S基因的表达分析间接免疫荧光结果图； 图4为嵌合HCV中和抗原表位及HBV S基因的表达分析Western blot条带结果 图； 图5为蔗糖密度梯度离心不同分离片段HBsAg定量分析图； 图6为纯化嵌合病毒样颗粒电镜分析结果图；其中，A:VLPs-SEl ;B:VLPs-SE2 ; C:VLPs-SE3 ；D:VLPs-SE4 ； 图7为纯化嵌合病毒样颗粒定量分析图； 图8为纯化嵌合病毒样颗粒免疫BALB/c小鼠中和抗体测定图谱； 图9为小鼠血清中和抗体抑制HCVpp感染Huh7. 5细胞分析图； 其中，A :为VLPs-SEl免疫小鼠血清对三种HCVpp的感染抑制作用结果分析图； B-D分别为VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SEl免疫小鼠血清对三种HCVpp的感染抑制作用结 果分析图；E为四种混合VLPs免疫小鼠血清对HCVpp的感染抑制作用结果分析图；F为佐本文档来自技高网...
【技术保护点】
嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒，其特征在于，该病毒样颗粒是将HCV表位插入HBV S抗原亲水区构建真核表达载体，再经哺乳动物细胞体外装配制得；其中，所述的HCV表位为氨基酸序列如SEQ.ID.NO：1～4中任意一项所示的表位。
【技术特征摘要】
1. 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒，其特征在于，该病毒样颗粒是将HCV表 位插入HBV S抗原亲水区构建真核表达载体，再经哺乳动物细胞体外装配制得； 其中，所述的HCV表位为氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?4中任意一项所示的表位。2. 根据权利要求1所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒，其特征在于， 氨基酸序列如SEQ. ID. NO :1?3所示的表位为高度保守的中和表位；氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示的表位为高变区的模拟表位。3. 根据权利要求2所述的嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒，其特征在于， 氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示的表位为HCV El区线性中和表位；氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 1和SEQ. ID. NO. 2所示的表位为HCV E2区线性中和表位；所述高变区的模拟表位为 HCV E2模拟表位。4. 嵌合HCV中和表位的HBV S抗原病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 在HBV S基因亲水区引入Age I克隆位点 将引入Age I克隆位点的全长S基因亚克隆至真核表达载体pCI-neo中，得到重组真 核表达载体PCI-HBS ; 2) 将HCV表位以引物合成的形式克隆入重组真核表达载体pCI-HBS中 以 pCI-HBS 为模板，分别用 FElAge I/R2Xba I，FE2Age I/R2Xba I，FE3Age I/R2Xba I，FE4Age I/R2Xba I为引物，扩增得到引入不同表位的HBV S下游128-227位氨基酸的 碱基序列，扩增产物回收后连接入T-easy载体，分别得到T-HBSE1，T-HBSE2, T-HBSE3和 T-HBSE4 ； 3)...
【专利技术属性】
技术研发人员：韦三华，张海，雷迎峰，舒放，林芳，王希，李斌，张利军，张惠中，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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