一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，包括1）提取病毒RNA；2）RT-PCR扩增；3）套式PCR扩增；4）PCR产物的克隆及测序分析等步骤。扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的S部分基因，扩增片段长782bp(位于S基因的1316bp-2097bp)，并且包含位于S基因1495bp-1914bp之间的中和抗原表位，实现能扩增在vero细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的S基因，捕捉到了猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中S基因，特别是中和抗原表位的序列变化，从而能了解其与PEDV免疫效力变化的相关性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及猪流行性腹泻病毒
，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法。
技术介绍
猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹湾病毒引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，各种年龄的猪均易感。猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因全长4150bp，由其编码的S蛋白位于病毒粒子表面。PEDV的S基因存在中和抗原表位，在S基因的1495bp-1914bp(420bp)之间。刘邓等人在《猪流行性腹泻病毒CH/ZJ分离株S基因的克隆、原核表达和疫苗原性分析》(黑龙江畜牧兽医，2010，.2:9-12)中从猪流行性腹泻病毒CH/ZJ分离株中扩增出长966bp (61bp-1026bp)的S部分基因，但是该序列不包含位于S基因1495bp_1914bp之间的中和抗原表位。姜艳平等人在《猪流行性腹泻病毒S基因片段的原核表达及其表达产物的反应原性》(中国兽医科学，2009, 39(07):602-607)从猪流行性腹泻病毒地方流行株LJB/03中扩增出了长420bp的PEDV中和抗原表位。但是这两种扩增方法均未说明是否能扩增出不同培养代次包括高代次的PEDV的S基因。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S部分基因，扩增片段长782bp (位于S基因的1316bp-2097bp)，并且包含位于S基因1495bp_1914bp之间的中和抗原表位，实现能扩增在veix)细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的S基因，以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中S基因，特别是中和抗原表位的序列变化，从而了解其与PEDV免疫效力变化的相关性。为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下: 一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其包括以下步骤: 1)提取病毒RNA:原病料经12000rpm离心5分钟后取上清液或者细胞培养液_20°C反复冻融 2-3 次,然后米用 TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0 提取病毒RNA ； 2)RT-PCR扩增:设计引物SEQ ID NO:1 和引物 SEQ ID NO: 2，采用 TaKaRa PrimeScriptone step RT-PCR Kit Ver.2 进行扩增； 3)套式PCR扩增:设计引物SEQID N0:3和引物SEQ ID NO:4，对步骤2中的RT-PCR扩增产物米用 TaKaRa Premix Taq Version 2.0 扩增； 4) PCR产物的克隆及测序分析:采用B10MIGA Ge I/PCR Extraction Kit进行PCR产物的纯化；将纯化的PCR产物连接到pMD20-T Vector载体上；连接产物转化DH5 α感受态细胞；筛选阳性克隆并进行测序。步骤I)米用 TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0 提取病毒RNA顺次按以下步骤进行: ①取200μ1病料处理液或冻融的细胞培养液放入1.5ml离心管中，加入200μ1的Solution A,剧烈振荡混勻后,室温放置5分钟； ②加入75μ1的SolutionB,混合均勻后,12000rpm离心5分钟； ③将上清液转移到新的CollectionTube中，加250μ1异丙醇,上下颠倒混勻； ④将试剂盒中的Spincolumn安置于另一新的Collection Tube上,将③中的上清液转移至Spin column中，12000rpm离心I分钟,弃滤液； ⑤将500μ1的RinseA加入至Spin column中，室温静置I分钟，12000rpm离心I分钟，弃滤液； ⑥将800M-1的RinseB加入至Spin column中，12000rpm离心I分钟，弃滤液； ⑦再次进行12000rpm离心I分钟； ⑧将Spincolum n安置于新的1.5ml离心管上,在Spin column膜的中央处加入50μ1的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置I分钟； ⑨12000rpm离心I分钟洗脱病毒RNA，提取的病毒RNA立即用于后续试验或_20°C保存。步骤2)中RT-PCR反应体系为 PrimeScript one step enzyme MixIM-1 2X1 step buffer12.5M-1 SEQ ID NO:1 (10μΜ)2μ1 SEQ ID NO:2 (10μΜ)2μ1RNA样品3μ1 RNase Free dH204.5M-1 ； 反应程序为94°C预变性2min ;94°C变性30s，53_54°C退火30s，72°C延伸lmin，设置30个循环；72°C延伸7min ;16°C保存。步骤3)中套式PCR扩增反应体系为 Premix Taq12.5M-1 RT-PCR 产物 1.5μ1 SEQ ID NO:3 (10μΜ) 2μ1 SEQ ID NO:4 (10μΜ) 2μ1 灭菌蒸馏水 7μ1 ； 反应程序为94°C预变性2min ;98°C变性10s，52_55°C退火30s，72°C延伸50s，设置30个循环；72°C延伸7min ;16°C保存。步骤4)中，所述PCR产物的纯化具体步骤如下: ①取100-200μ1的PCR产物，加入2倍体积的Buffer GC,混合均匀，瞬时离心，将溶液收集到底部； ②将以上混合液加入带有收集管的吸附柱中，室温下，13000rpm离心I分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中；重复步骤②，直至剩余的混合液全部通过吸附柱； ③加入650PLDNA Wash Buffer至吸附柱下，室温下，13000rpm离心30秒，弃去流出液；重复步骤③； ④室温下，13000rpm，将吸附柱开盖离心2分钟，去除残留的乙醇； ⑤转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30_50μ1 60°C预热的Elution Buffer或灭菌蒸馏水到吸附柱膜中央，室温放置I分钟，13000rpm离心I分钟，洗脱DNA，将洗脱液加回到吸附柱中重新洗脱一次，洗脱的DNA立即用于后续试验或_20°C保存。步骤4)中，将纯化的PCR产物连接到pMD20-T Vector载体上具体步骤如下: ①在1.5ml离心管中配制下列溶液，全量为5μ1 ； pMD20_T Vector μ PCR纯化产物2μ1 蒸馏水2μ1 ②加入5μ1 的 Solution I ； ③16°C反应30分钟； ④洗脱的DNA与pMD20-TVector的连接产物_20°C保存。步骤4)中，连接产物转化DH5 α感受态细胞顺次按以下步骤进行: ①取3μ1连接产物放入100μ1DH5 α感受态细胞悬液中，轻轻混匀； ②冰上放置20-30分钟，然后42°C水浴热激90秒，迅速冰上冷却2分钟； ③立即加入0.8mlLB液体培养基，摇匀后于37°C 150_180rpm振荡培养45-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于其包括以下步骤：1）提取病毒RNA：原病料经12000rpm离心5分钟后取上清液或者细胞培养液?20℃反复冻融2?3次，然后采用TaKaRa?miniBEST?viral?RNA/DNA?extraction?kit?Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA；2）RT?PCR扩增：设计引物SEQ?ID?NO:1和引物SEQ?ID?NO:2，采用TaKaRa?PrimeScript?one?step?RT?PCR?Kit?Ver.2进行扩增；?3）套式PCR扩增：设计引物SEQ?ID?NO:3和引物SEQ?ID?NO:4，对步骤2中的RT?PCR扩增产物采用TaKaRa?Premix?Taq?Version?2.0(D334S)扩增；4）PCR产物的克隆及测序分析：采用BIOMIGA?Gel/PCR??Extraction?Kit进行PCR产物的纯化；将纯化的PCR产物连接到pMD20?T?Vector载体上；连接产物转化DH5α感受态细胞；筛选阳性克隆并进行测序。

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于其包括以下步骤: 1)提取病毒RNA:原病料经12000rpm离心5分钟后取上清液或者细胞培养液-20°C 反复冻融 2-3 次，然后米用 TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kitVer.4.0 (DV819A)提取病毒 RNA ； 2)RT-PCR扩增:设计引物SEQ ID NO:1 和引物 SEQ ID NO: 2，采用 TaKaRa PrimeScriptone step RT-PCR Kit Ver.2 进行扩增； 3)套式PCR扩增:设计引物SEQID N0:3和引物SEQ ID NO:4，对步骤2中的RT-PCR扩增产物采用 TaKaRa Premix Taq Version 2.0 (D334S)扩增； 4)PCR产物的克隆及测序分析:采用B10MIGA Ge I/PCR Extraction Kit进行PCR产物的纯化；将纯化的PCR产物连接到pMD20-T Vector载体上；连接产物转化DH5 α感受态细胞；筛选阳性克隆并进行测序。2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于步骤 I)米用 TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0 提取病毒 RNA 顺次按以下步骤进行: ①取200μ1病料处理液或冻融的细胞培养液放入1.5ml离心管中，加入200μ1的Solution A,剧烈振荡混勻后,室温放置5分钟； ②加入75μ1的SolutionB,混合均勻后,12000rpm离心5分钟； ③将上清液转移到新的CollectionTube中，加250μ1异丙醇,上下颠倒混勻； ④将试剂盒中的Spincolumn安置于另一新的Collection Tube上,将③中的上清液转移至Spin column中,12000rpm离心I分钟，弃滤液； ⑤将500μ1的RinseA加入至Spin column中，室温静置I分钟，12000rpm离心I分钟，弃滤液； ⑥将800M-1的RinseB加入至Spin column中,12000rpm离心I分钟,弃滤液； ⑦再次进行12000rpm离心I分钟； ⑧将Spincolumn安置于新的1.5ml离心管上,在Spin column膜的中央处加入50μ1的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置I分钟； ⑨12000rpm离心I分钟洗脱病毒RNA，提取的病毒RNA立即用于后续试验或_20°C保存。3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于:步骤2)中RT-PCR反应体系为 PrimeScript one step enzyme MixIM-1 2X1 step buffer12.5M-1 SEQ ID NO:1 (ΙΟμΜ)2μ1 SEQ ID NO:2 (ΙΟμΜ)2μ1RNA样品3μ1 RNase Free dH204.5M-1 ； 反应程序为94°C预变性2min ;94°C变性30s，53_54°C退火30s，72°C延伸lmin，设置30个循环；72°C延伸7min ;16°C保存。4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒S基因抗原表位的扩增方法，其特征在于:步骤3)中套式PCR扩增反应体系为 Premix Taq12.5M-1 RT-PCR 产物1.5μ1 SEQ ID NO:3 (Ι...

【专利技术属性】
技术研发人员：何玲，陈瑞爱，唐满华，梁桂益，
申请(专利权)人：广东大华农动物保健品股份有限公司，肇庆大华农生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：