本发明专利技术公开了一种结核Ｈｓｐ６５和Ｅｓａｔ６融合抗原基因及其玉米表达载体和应用。该玉米表达载体的构建方法是：（１）根据人结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ株Ｈｓｐ６５和Ｅｓａｔ６基因的编码序列设计融合抗原基因Ｈｓｐ６５－ｌｉｎｋｅｒ－Ｅｓａｔ６的１对引物Ｐ１和Ｐ２；（２）以质粒ｐＥＧＦＰＨｓｐ６５－Ｅｓａｔ６为模板，用引物Ｐ１和Ｐ２进行常规链式聚合酶反应扩增Ｈｓｐ６５－ｌｉｎｋｅｒ－Ｅｓａｔ６；（３）ｐＣＲ－Ｇ载体的构建；（４）ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ｎｏｓ－ｂａｒ载体的构建；（５）中间载体ｐＣＲＧＨＬＥ的克隆与构建；（６）目的载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ＧＨＬＥ的克隆与构建。本发明专利技术结核Ｈｓｐ６５和Ｅｓａｔ６融合抗原基因的表达载体可用于制备疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及结核Hsp65和Esat6融合抗原基因及其玉米表达载体和应用， 属于生物医学工程领域。
技术介绍
结核病是一种严重危害人类健康的传染性疾病，由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)感染引起。全球大约有三分之一的人感染 过结核(大约21亿)，每年新发病1000万人，卡介苗(BCG)作为预防结核病的 疫苗，近100年来虽然广泛用于新生儿的预防接种，但保护率只有50%左右， 而对成年人的保护率在不同地区，在0 80°/。之间波动；另外接种BCG还能使 少数人发生较严重的并发症，发生播散性感染而致死。鉴于结核病发生的严 重态势，加强结核病的防治工作、探索结核病的早期诊断及研制开发新型预 防、治疗的疫苗，已成为当前国际乃至我国关注的紧迫而优先的课题。新型抗结核疫苗的研制，选取优势抗原最为重要。结核分枝杆菌的Hsp65 蛋白(热休克蛋白65KD)属于Hsp70家族，有很强的免疫原性，能诱导和增 强机体的体液免疫和细胞免疫的发生，并可激活yST細胞，可以在动物体 内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应，是人体感染结核杆菌 以后免疫系统的主要靶抗原和T细胞攻击的主要对象。因此Hsp65是一种理想 的疫苗候选抗原。来源于结核分支杆菌Esat6是一种非常重要的T细胞免疫 原，是MTB培养早期分泌的相对分子质量为6kD的早期分泌性抗原靶(6kD early secretory antigenic target, Esat6)，由结核分枝杆菌RD1区Y277片 段编码，全长288bp，编码95个氨基酸。Esat6在机体产生保护性免疫应答中， 通过活化巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等释放炎症递质肿瘤坏死因子和 组胺等；并参与诱导树突状细胞分化、成熟并促进y干扰素介导的Esat-6特 异性Thl细胞产生的过程。虽然Hsp65抗原和Esat6分别在感染免疫中的作用 已经被研究证实有效,但对Esat6协同Hsp65抗原在结核杆菌感染中的免疫应 答特点和保护力尚不清楚。转基因植物生物反应器是利用基因工程重组技术和植物自生代谢原理 产生具有特殊功能的蛋白，常见的有人或动物的保护性抗原蛋白、抗体和一 些重要的多肽等，它们具有重要药用价值和商业市场。转基因植物生物反应 器和微生物反应器、动物反应器相比较具有生产成本低、表达产物具有天然 的生物活性、安全性好的优点，这也是转基因植物得到迅速发展的重要原因 之一。启动子是调控外源基因在植物体内表达的开关，它直接影响到外源基因 在植物体内的丰度、表达组织或发育时期，所以，能否选择到适宜受体植物 的启动子使其有较高的表达量，成为转基因植物发展的一个瓶颈问题。植物表达启动子分为三种组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型 启动子。目前在绝大多数双子叶转基因植物中广泛使用的启动子是来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的 Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子等。CaMV35S、 Actinl、 Ubiquitin等均为强组成型启动子，控制外源的基因在转基因植株的各个部 位和整个生育期表达。CaMV35S启动子在双子叶植物中的表达效率高于单子 叶植物，而Actinl、 Ubiquitin等启动子在单子叶植物中的表达效率较高， 这可能与单、双子叶植物，在转录因子和启动子序列识别上有差异。选择合适的植物表达启动子，是解决表达量低的有效途径，而选择的依 据主要以受体材料的特性来决定。在植物基因工程研究中， 一个表达载体系 统是至关重要的。目前报道植物转基因研究中多采用高效组成型启动子，如 CaMV35S、画V启动子等，在它们调控下，外源基因在转基因植物中所有的发 育阶段和所有的部位都能表达，这在转抗病基因和抗虫基因时，会收到较好 的效果。但对表达特殊营养成分的基因，例如表达乙肝抗原基因等，外源基 因在植物内持续高效的表达，不仅造成营养成分的浪费，而且往往会造成植 物形态的改变，严重时还会影响到植物的正常发育。
技术实现思路
本专利技术的目在于克服现有技术的缺点，提供一种结核Hsp65和Esat6融 合抗原基因。本专利技术的另一 目的在于提供一种包含上述结核Hsp65和Esat6融合抗原 基因的玉米表达载体的构建方法。本专利技术的再一 目的在于提供上述方法构建的玉米表达载体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现 一种结核Hsp65和Esat6融合抗 原基因，其序列如SEQ ID N0.5所述。一种包含了上述结核Hsp65和Esat6融合抗原基因的玉米表达载体的构 建方法，包括以下步骤(1) 根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65和Esat6基因的编码序列设 计融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的1对引物上游引物序列为Pl 5' - TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTG - 3'，含 BglII酶切位点和起始密码子ATG;下游引物序列为P2 5' - GC TCTAGA CTATGCGAACATCCCAGTG - 3'，含 Xba I酶切位点和终止密码子CTA;(2) 以质粒pEGFPHsp65-Esat6为模板，用步骤(1)设计的引物Pl和 P2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp65-linker-Esat6;(3) pCR-G载体的构建用HindIII和BamHI分别双酶切质粒pUBCG和pCR 2. 1，经琼脂糖电泳 分离，从pUBCG酶切产物回收1. 4kb的玉米种子特异表达启动子Globulin-l， 从pCR 2. 1酶切产物回收3. 9kb的载体片段，将两个回收片段连接、转化获 得重组质粒pCR-G;(4) pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建用Sacl和EcoRI分别双酶切质粒pGFP-2和pUC18，经琼脂糖电泳分离， 从pGFP-2酶切产物中回收270bp的nos片段，从pUC18酶切产物中回收2. 6kb 的载体片段，将两个回收片段以T4连接酶连接、转化获得重组质粒pUC18-nos;用Xbal和EcoRI酶切pUC18-nos，回收含有nos及多克隆位点的DNA 片段，与经相同处理的质粒pC層BIA-1300连接、转化获得重组质粒 pCAMBIA-1300-nos;用XhoI酶切质粒pMDXl，回收560bp的bar基因片段，用Xhol切除质 粒pCAMBIA-1300-nos内潮霉素抗性基因，回收pCAMBIA-1300-nos并进行末 端脱磷酸；将bar基因片段与pCAMBIA-1300-nos连接、转化获得重组质粒 pCAMBIA1300-nos-bar;(5)中间载体pCRGHLE的克隆与构建用BamHI和Xbal分别双酶切步骤(3)所得质粒pCR-G和步骤(2)所 得Hsp65-linker-Esat6，经琼脂糖电泳分离，纯化后进行连接、转化筛选获 得重组载体pCRGHLE;(6)目的载体pCAMBIA1300GHLE的克隆与构建用HindIII和Xbal双酶切步骤(5)所得重组载体pCRGHLE，得到 globulin-1和Hsp65-linker-Esat6的联合片段，将HindIII和Xbal双酶切 步骤(4)所得pCAMB本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种结核Ｈｓｐ６５和Ｅｓａｔ６融合抗原基因，其特征在于：其序列如ＳＥＱＩＤ ＮＯ．１所述。
【技术特征摘要】
1、一种结核Hsp65和Esat6融合抗原基因，其特征在于其序列如SEQID NO.1所述。2、 一种包含了权利要求1所述结核Hsp65和Esat6融合抗原基因的玉米表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1) 根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65和Esat6基因的编码序列设 计融合抗原基因Hsp65-linker-Esat6的1对引物上游引物序列为Pl 5' - TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTG - 3'，含 BglII酶切位点和起始密码子ATG;下游引物序列为P2 5' - GC TCTAGA CTATGCGAACATCCCAGTG - 3'，含 Xba I酶切位点和终止密码子CTA;(2) 以质粒pEGFPHsp65-Esat6为模板，用歩骤(1)设计的引物Pl和 P2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp65-1 inker-Esat6;(3) pCR-G载体的构建用HindIII和BamHI分别双酶切质粒pUBCG和pCR 2. 1，经琼脂糖电泳 分离，从pUBCG酶切产物回收1.4kb的玉米种子特异表达启动子globulin-l， 从PCR 2. 1酶切产物回收3. 9kb的载体片段，将两个回收片段连接、转化获 得重组质粒pCR-G;(4) pCAMBIA1300-nos-bar载体的构建用Sacl和EcoRI分别双酶切质粒pGFP-2和pUC18，经琼脂糖电泳分离， 从pGFP-2酶切产物中回收270bp的nos片段，从pUC18酶切产物中回收2. 6kb 的载体片段，将两个回收片段连接、转化获得重组质粒pUC18-nos;用XbaI 和EcoRI酶切pUC18-nos，回收含有nos及多克隆位点的DNA片段，与经相 同处理的质粒pCAMBIA-1300连接、转化获得重组质粒pCAMBIA-1300-nos;用XhoI酶切质粒pMD...
【专利技术属性】
技术研发人员：李君武，胡建广，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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