乙肝核心抗原病毒样颗粒作为肿瘤治疗性疫苗载体的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说，本发明专利技术提供了一种乙肝核心抗原病毒样颗粒（HBcAg）作为宫颈癌治疗性疫苗载体的应用。其制备方法：选择HPV16 E749-57CTLs表位肽段，经基因重组将其DNA片段插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之间，得到的重组质粒pHBcAg-E749-57转化入大肠杆菌DH5α，经诱导表达及纯化，得到呈递E749-57的HBcAg病毒样颗粒疫苗。经该病毒样颗粒疫苗免疫荷瘤小鼠后能够诱导机体产生较强的HPV16E7特异性的细胞免疫应答，并显著抑制肿瘤的生长。

Application of hepatitis B core antigen virus like particles as tumor therapeutic vaccine carrier

The invention relates to the field of molecular biology and immunology, in particular to an application of hepatitis B core antigen virus like particles (HBcAg) as a therapeutic vaccine vector for cervical cancer. The preparation methods: HPV16 E749-57CTLs epitope peptide, by gene recombination between 78-79 amino acids in the DNA fragment was inserted into hepatitis B virus core antigen HBcAg, the recombinant plasmid pHBcAg-E749-57 was transformed into Escherichia coli DH5 alpha, by inducing expression and purification, get a HBcAg virus like particle vaccine delivery E749-57. The mice immunized with the virus like particle vaccine can induce a strong HPV16E7 specific cellular immune response and inhibit the growth of tumor.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种乙肝核心抗原病毒样颗粒（HBcAg）作为肿瘤治疗性疫苗载体的构建方法及其应用。
技术介绍
宫颈癌是威害妇女健康最为严重的疾病之一，在女性肿瘤发病率中占第二位。在全世界范围内，每年大约有49.3万个新发病例和27.4万个死亡病例，而在所有的宫颈癌病例中几乎都可检测到HPV的存在。HPV感染还引起肛门癌，外阴癌,阴道癌和阴茎癌，此外，HPV感染也是头颈癌等非生殖道癌发生的重要原因。现在已经明确高危型HPV的持续感染是宫颈癌发生和存在的必要因素。而在高危型HPV中，16、18型与70%的宫颈癌相关。尽管国际上已商业化的预防性HPV疫苗能够诱导有效的抗体免疫应答并且针对特定的HPV型别如HPV16和18等多数高危型HPV的感染产生显著的保护作用，但是其对于已经建立的HPV感染或肿瘤，没有明显治疗效果。因此，研制治疗性HPV疫苗，针对癌前病变和肿瘤进行免疫治疗，具有对HPV相关疾病治疗控制的广阔应用前景。HPVE6、E7是导致细胞发生转化的关键因子，在宫颈癌细胞中持续表达，因此目前治疗性HPV疫苗的研究主要致力于通过靶向E6和E7诱导强的特异的T细胞介导的免疫应答。策略包括：1）表位氨基酸修饰以增强与MHC分子的亲合力；2）抗原修饰改造以指导其加工递呈途径与效率；3）引入细胞因子、趋化因子，共刺激分子以增强及控制免疫应答向所需类型发展；4）优化疫苗递送途径和免疫程序；以及5）利用抗原肽/蛋白、细菌与病毒活载体、核酸、及细胞等不同疫苗形式。然而，目前为止没有任何治疗性HPV疫苗针对CIN病人或肿瘤患者产生有效的临床治疗效果。因此，我们亟需一个在肿瘤免疫抑制和免疫逃逸的微环境下能够诱导强有力的肿瘤特异性细胞免疫应答的候选疫苗。应用有效的载体增强特异性抗原的免疫原性是一个重要的疫苗学手段。乙肝核心抗原（HBcAg）能够在大肠杆菌E.coli中有效的自我组装成病毒样颗粒，并且其结构的固有特点使得它具有很强的免疫原性并能产生高滴度的特异性抗体。因此HBcAg颗粒已经成为一个应用广泛的呈递异源抗原并诱导体液免疫应答的强有力的疫苗载体。此外，呈递自体分子和抗原肽的HBcAg病毒样颗粒能够打破免疫耐受，诱导特异的自身抗体并在疾病模型中成功干预功能紊乱的靶分子引起的病理效应。然而，HBcAg病毒样颗粒是否具有作为治疗性疫苗载体并促进抗原特异的细胞免疫应答的潜能仍未确定。本研究旨在探讨呈递HPV16E7CTLs模式表位的HBcAg病毒样颗粒疫苗是否具有诱导肿瘤特异性的细胞免疫应答和抑制肿瘤生长的能力，明确HBcAg病毒样颗粒作为治疗性疫苗载体的潜能。
技术实现思路
编码E749-57的正负寡核苷酸片段退火复性获得DNA片段，并以基因工程手段连入乙肝核心抗原HBcAg第78和79为氨基酸之间，将重组质粒转化进入大肠杆菌Dh5α后挑取阳性重组子，提取质粒进行测序鉴定。将pHBcAg-E749-57重组质粒转化进Dh5α感受态细胞，以IPTG诱导表达重组蛋白HBcAg-E749-57，表达产物经超声破碎后收集上清中的重组蛋白。重组蛋白经硫酸铵盐析法和10%～50%的蔗糖密度梯度离心进行纯化。纯化的重组蛋白进行HPLC分析，根据出峰时间鉴定重组蛋白是否组装成病毒样颗粒及其纯度。此外，通过电镜观察组装成病毒样颗粒（VLPs）和未组装成病毒样颗粒（non-VLPs）的重组蛋白形态。将该病毒样颗粒以治疗性策略免疫小鼠，观察小鼠肿瘤生长情况，发现以HBcAg-E749-57病毒样颗粒的形式免疫后，小鼠肿瘤生长受到显著抑制；观测时间点结束后，收集免疫后的小鼠脾脏，进行ELISPOT检测分泌IFN-γ的淋巴细胞数目，发现以HBcAg-E749-57病毒样颗粒免疫后，小鼠体内产生了较高水平的分泌IFN-γ的淋巴细胞数目。应用免疫记忆实验检测HBcAg-E749-57病毒样颗粒疫苗对小鼠的保护性持续时间，发现小鼠在第三次免疫后15周仍然存在免疫记忆应答，小鼠接种肿瘤细胞后，ELISPOT检测显示疫苗组显著提高了分泌IFN-γ的淋巴细胞水平。附图说明图1显示了重组质粒pHBcAg-E749-57的质粒构建图谱；图2显示了SDS-PAGE分析重组蛋白HBcAg-E749-57的诱导表达；图3显示了重组蛋白HBcAg-E749-57蔗糖密度梯度离心的SDS-PAGE分析；图4显示了重组蛋白HBcAg-E749-57病毒样颗粒形式（VLPs）的纯度和形态的HPLC凝胶过滤分析；图5显示了重组蛋白HBcAg-E749-57非病毒样颗粒形式（non-VLPs）的纯度和形态的HPLC凝胶过滤分析；图6显示了电镜观察到重组蛋白HBcAg-E749-57形成VLPs的形态；图7显示了电镜观察到重组蛋白HBcAg-E749-57形成non-VLPs的形态；图8显示了病毒样颗粒疫苗以治疗性策略免疫小鼠后显著抑制了肿瘤的生长（n=9/组）；图9显示了经ELISPOT分析，病毒样颗粒疫苗以治疗性策略免疫小鼠后显著提高了分泌IFN-γ的淋巴细胞水平（n=5/组）；图10显示了免疫记忆实验的实验程序；图11显示了经ELISPOT分析，病毒样颗粒疫苗第三次免疫后15周小鼠仍然存在免疫应答（n=4/组）；图12显示了病毒样颗粒疫苗免疫第三次免疫15周后仍然产生了显著的肿瘤抑制效果（n=10/组）；图13显示了免疫记忆实验肿瘤接种后1周，经ELISPOT分析，病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后产生了高水平的分泌IFN-γ的淋巴细胞（n=4/组）。具体实施方式通过以下实施例详细描述本专利技术，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本专利技术。下述实施例仅仅出于示范性目的，并非意在限制本专利技术的范围。已经努力确保有关数字的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。实施例实施例1：重组表达质粒pHBcAg-E749-57的构建编码E749-57的寡核苷酸序列（正链：5’-gatctCGTGCTCACTACAACATCGTTACCTTCggatccggtg-3’;负链:5’-aattcaccggatccGAAGGTAACGATGTTGTAGTGAGCACGa-3’）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。在10μl的体系内正负寡核苷酸片段以0.1mM的浓度1:1混合退火复性，复性体系具体为：正负寡核苷酸各2μl，10×PCRBuffer1μl，水5μl。在95℃的条件下变性30秒，缓慢直至冷却至室温退火复性，从而形成编码抗原肽的双链DNA片段。形成的双链DNA片段构建至pThioHisA-HBcAg载体BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间。载体pThioHisA-HBcAg，由本室构建，是将改造过的HBcAg（1-149氨基酸）基因克隆于pThioHisA表达载体（图1）。连接体系为：E749-57DNA片段2.84μl，pThioHisA-HBcAg载体6.14μl，10×T4Buffer1.5μl，T4连接酶1μl，水：3.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙肝核心抗原病毒样颗粒（HBcAg）可以作为肿瘤治疗性疫苗的载体，其特征在于：将肿瘤抗原呈递于HBcAg表面后能在机体内诱发较强的针对所呈递抗原的细胞免疫应答，诱导机体产生有效的免疫记忆，对人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤具有显著的抑制作用。

【技术特征摘要】
1.一种乙肝核心抗原病毒样颗粒（HBcAg）可以作为肿瘤治疗性疫苗的载体，其特征在于：将肿瘤抗原呈递于HBcAg表面后能在机体内诱发较强的针对所呈递抗原的细胞免疫应答，诱导机体产生有效的免疫记忆，对人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤具有显著的抑制作用。
2.该乙肝核心抗原病毒样颗粒作为宫颈癌治疗性疫苗载体的构建，其方法为：将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcA...

【专利技术属性】
技术研发人员：马雁冰，褚晓杰，李杨，龙琼，夏烨，黄惟巍，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53