本发明专利技术公开了一种异丙威半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。所述异丙威半抗原的结构式如式(Ⅰ)所示；所述异丙威人工抗原的结构式如式(Ⅱ)所示。基于本发明专利技术半抗原和人工抗原制备得到的抗体的线性范围为1.88～82.8ng/mL，最低检测限为0.54ng/mL，半抑制浓度为11.7ng/mL，所述抗体特异性、灵敏度和准确度均较高，本发明专利技术抗原及抗体在农产品中异丙威的残留检测方面具有广泛的应用前景。
Hapten, artificial antigen, antibody, preparation method and application thereof
The invention discloses a method for preparing hapten, artificial antigen, antibody, preparation method and application thereof. The structural formula of the hapten is shown in formula (I), and the structural formula of the artificial antigen is shown in formula (II). The linear range of antibody prepared by the invention hapten and artificial antigen system based on 1.88 ~ 82.8ng/mL, the minimum detection limit is 0.54ng/mL, half inhibitory concentration 11.7ng/mL, the antibody specificity, high sensitivity and accuracy, and has wide application prospect for residue detection of antigens and antibodies in the aspect of the present invention in different agricultural products Wei bing.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品安全检测
，更具体地，涉及一种异丙威半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
异丙威(Isoprocarb,MIPC)又名灭扑散、叶蝉散，分子式为C11H15NO2，化学名称为2-异丙基苯基-N-甲基氨基甲酸酯，是氨基甲酸酯类杀虫剂中的一种，其结构式如(Ⅲ)所示。异丙威能够通过抑制昆虫体内的乙酰胆碱酯酶的生物活性，从而将昆虫麻痹致死，在果蔬、粮食、烟草等中都有广泛应用。然而这类农药也具有较强生物毒性。目前常见的异丙威检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，然而这些检测方法都存在仪器设备昂贵、前处理复杂、检验周期长等缺陷，不能满足大批量样品的快速检测。因此，有必要研制更加简单快捷方便的检测方法。免疫检测方法是目前食品安全快速检测的重要方法之一，具有灵敏度高、特异性强、前处理简单、检验周期短、适用于大批量样品检测等优点，研究人员已利用该方法开发了多种药物的快速检产品，并已得到了市场的认可，然而，目前尚未出现针对异丙威的免疫检测方法及产品的相关技术报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对异丙威现有检测技术的不足，提供一种异丙威半抗原。本专利技术要解决的另一技术问题是提供所述异丙威半抗原的制备方法。本专利技术还一要解决的技术问题是提供异丙威人工抗原。本专利技术同时要解决的技术问题是提供所述异丙威人工抗原的应用。本专利技术还一要解决的技术问题是提供所述异丙威人工抗原的制备方法。本专利技术还一要解决的技术问题是提供异丙威抗体以及抗体的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：提供一种异丙威半抗原，其结构式如式(Ⅰ)所示：其中，n为-CH2基团数目，n＝1～6。本专利技术同时提供了所述异丙威半抗原的制备方法，包括以下步骤：S01.将2-异丙基苯酚溶于二氯甲烷，加入吡啶形成混合溶液，于冰浴下，将对硝基苯氯甲酸酯加到所述混合溶液中，反应；S02.步骤S01所述的反应结束后，洗涤反应产物，取有机相进行干燥，减压蒸馏，得到的产物用溶剂溶解；得溶液1；将4-氨基丁酸溶于饱和碳酸氢钠溶液中，得溶液2；S03.于冰水浴中，将溶液1加入溶液2中反应，反应结束后，调节反应所得反应液的pH值为微酸性，用有机溶剂萃取，取有机相干燥，过柱纯化，收集目标组分，减压蒸馏除去溶剂即得。优选地，步骤S01所述将对硝基苯氯甲酸酯加到所述混合溶液中是采用滴加的方式。所述冰浴优选采用4℃冰盐浴。优选地，步骤S02所述洗涤是采用稀盐酸溶液；进一步优选所述的稀盐酸溶液的浓度为1～6M。优选地，所述干燥采用无水硫酸钠；优选地，步骤S02所述溶剂为四氢呋喃；优选地，步骤S03所述调节反应液的pH值采用盐酸溶液；优选地，步骤S03所述有机溶剂为乙酸乙酯；所述干燥采用无水硫酸钠。优选地，步骤S03所述盐酸溶液的浓度为4mol/L；所述pH值为6；优选地，步骤S01所述2-异丙基苯酚和硝基苯氯甲酸酯的摩尔比为1:1.2～1:2，所述反应的时间为2～5h。优选地，步骤S02所述产物和4-氨基丁酸的摩尔比为1:1.5～1:10。优选地，步骤S03所述过柱纯化是采用200～300目硅胶柱纯化。本专利技术提供一种异丙威人工抗原，其结构式如式(Ⅱ)所示：其中，n为-CH2基团数目，n＝1～6。本专利技术同时提供所述异丙威人工抗原在制备异丙威抗体或检测异丙威中的应用。本专利技术同时提供所述异丙威人工抗原的制备方法，是采用活泼酯法将所述异丙威半抗原(Ⅰ)与载体蛋白偶联制备得到。具体地，所述异丙威人工抗原的制备方法，包括以下步骤：S11.将本专利技术所述异丙威半抗原溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中形成混合溶液，在所述混合溶液中加入1，3-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌反应过夜，离心后取上清液；S12.将步骤S11所得上清液加入载体蛋白的碳酸盐(pH9.6)缓冲溶液中，室温下搅拌反应，反应结束后，将所得反应液透析得到所述异丙威人工抗原。优选地，步骤S11所述异丙威半抗原与载体蛋白的质量比为1:10～1:60。优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白或血蓝蛋白。优选地，步骤S12所述反应的时间为8h。本专利技术同时提供采用所述异丙威人工抗原制备得到的异丙威抗体，以及所述抗体在检测异丙威中的应用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次提供了一种新的异丙威半抗原，基于所述异丙威半抗原可简单易行地制备得到异丙威人工抗原和特异性抗体，所述抗体的线性范围为1.88～82.8ng/mL，最低检测限为0.54ng/mL，半抑制浓度为11.7ng/mL，所述抗体特异性、灵敏度、准确度均较高，可很好地应用于建立异丙威得免疫分析技术，克服现有异丙威残留的仪器检测方法设备昂贵、前处理复杂、检验周期长等缺陷，从而实现快速检测农产品中异丙威残留，具有广阔的应用前景。附图说明图1为异丙威半抗原的制备工艺的流程图。图2异丙威半抗原质谱图。图3异丙威人工抗原的制备工艺的流程图。图4异丙威抗体的ELISA竞争标准曲线图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例进一步说明本专利技术方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利技术的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。实施例1异丙威半抗原的制备方法：异丙威半抗原的制备方法反应过程如图1所示。具体步骤如下：S01.称取1.36g2-异丙基苯酚溶于20mL二氯甲烷后，加入0.5mL吡啶形成混合溶液，于4℃冰盐浴下，滴加2.0g对硝基苯氯甲酸酯到混合溶液中，反应3h；S02.用摩尔浓度为6M的稀盐酸对步骤S01反应所得反应液进行洗涤，取有机相用无水Na2SO4干燥，然后进行减压蒸馏；取上述制得的产物(0.67g)溶于12mL四氢呋喃中，得溶液1；将0.3g(2.4mmol)4-氨基丁酸溶于5mL饱和碳酸氢钠溶液中，得溶液2；S03.于冰水浴中，将溶液1加入溶液2中反应4.5h后，向反应液中继续滴加4mol/L的HCl溶液，将反应液的pH值调为微酸性，用乙酸乙酯萃取3次，取有机相加无水Na2SO4干燥，用200～300目硅胶柱纯化，得到异丙威半抗原，异丙威半抗原质谱图如图2所示。实施例2异丙威人工抗原的制备方法如附图3所示，本实施例提供异丙威免疫原/包被原的制备方法如下：本实施例免疫原与包被原的制备不同之处在于载体蛋白，所述免疫原载体蛋白采用牛血清蛋白(BSA)，所述包被原载体蛋白采用卵清蛋白(OVA)。以下所述以免疫原的制备方法为例。取100μmol实施例1所得异丙威半抗原，溶解于0.5mLDMF中，然后在该溶液中加入等摩尔的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下搅拌过夜反应后离心，取上清液缓慢加入到5mL15mg/mL的载体蛋白的碳酸盐(pH9.6)的碳酸盐缓冲溶液中，然后搅拌反应8h，待反应完成后，再将反应液装入透析袋，用0.01mol/LPBS(pH7.4)缓冲溶液透析3天，每天更换3次透析液，然后将透析液于4000转/min离心5min，取上清液液于-20℃保存，供免疫用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种异丙威半抗原，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：其中，n为‑CH2基团数目，n＝1～6。
【技术特征摘要】
1.一种异丙威半抗原，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：其中，n为-CH2基团数目，n＝1～6。2.一种权利要求1所述异丙威半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S01.将2-异丙基苯酚溶于二氯甲烷，加入吡啶形成混合溶液，于冰浴下，将对硝基苯氯甲酸酯加到所述混合溶液中，反应；S02.步骤S01所述的反应结束后，洗涤反应产物，取有机相进行干燥，减压蒸馏，得到的产物用溶剂溶解；得溶液1；将4-氨基丁酸溶于饱和碳酸氢钠溶液中，得溶液2；S03.于冰水浴中，将溶液1加入溶液2中反应，反应结束后，调节反应所得反应液的pH值为微酸性，用有机溶剂萃取，取有机相干燥，过柱纯化，收集目标组分，减压蒸馏除去溶剂即得；优选步骤S02所述洗涤是采用盐酸溶液；所述干燥采用无水硫酸钠；优选步骤S02所述溶剂为四氢呋喃；优选步骤S03所述调节反应液的pH值采用盐酸溶液；优选步骤S03所述有机溶剂为乙酸乙酯；所述干燥采用无水硫酸钠。3.根据权利要求2所述异丙威半抗原的制备方法，其特征在于，优选步骤S01所述将对硝基苯氯甲酸酯加到所述混合溶液中是采用滴加；步骤S03所述调节反应所得反应液的pH值为微酸性是采用盐酸溶液；优选所述盐酸溶液的浓度为4mol/L；优选所述pH值为6。4.根据权利要求2所述异丙威半抗原的制备方法，其特征在于，步骤S01所述2-异丙基苯酚和硝基苯氯甲酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘辉，熊波，张燕，唐穗平，邓幸飞，
申请(专利权)人：广东产品质量监督检验研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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