三聚氰胺半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用技术

本发明专利技术公开了一种三聚氰胺半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用。本发明专利技术提供的半抗原，为式（Ⅰ）所示的化合物。本发明专利技术还保护式（Ⅰ）所示的化合物与载体蛋白的偶联物（该偶联物为免疫原或包被原）。本发明专利技术还保护一种用于检测三聚氰胺的化学发光免疫试剂盒，包括包被有所述偶联物的化学发光微孔板（偶联物作为包被原）。所述试剂盒还可包括以所述偶联物为免疫原得到的抗体。本发明专利技术提供的试剂盒操作简便、特异性好、灵敏度高，各项性能优良，非常适于推广应用。式（Ⅰ）。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种半抗原、抗原及其制备方法，具体涉及一种三聚氰胺半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用。
技术介绍
三聚氰胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精，分子式C3N6H6，分子量126.12。由于三聚氰胺的分子式中含氮量为66%左右，而蛋白质的平均含氮量为16%左右，因此，由于食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，俗称“蛋白精”。虽然，目前广泛认为三聚氰胺毒性比较低微，但长期摄入仍不容忽视。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片说明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。2011年4月6日，国家五部委发表联合公告，制定我国三聚氰胺在食品中的限量值。公告规定：婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg，高于上述限量的食品一律不得销售。这项标准与国际食品法典委员会发布的限量一致，而国际食品法典委员发布的标准被公认为食品领域的国际标准。目前，饲料和食品中三聚氰胺残留的检测方法采用仪器分析法和免疫分析法。例如，酶联免疫吸附法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）、气质联用法（GC-MS）和液质联用法（LC-MS/MS）等。由于三聚氰胺属于极强性化合物，在色谱柱上几乎无保留，在进行分析时一般都要在流动相中加入离子对试剂来改善分离条件，在色谱柱上获得稳定的保留；同时，由于测定的样品中一般含有大量蛋白质，因此在进行提取时要加入蛋白质沉淀剂来除去蛋白。HPLC法具有定量准确等优点，但在检测时前处理相对复杂，在实际应用中存在方法灵敏度低等缺点。对于三聚氰胺残留的确证已有报道的方法有GC-MS和LC-MS/MS。由于三聚氰胺相对分子质量小于150，在进行GC-MS分析时在该质量数附近常用的毛细管气象色谱柱柱流失产物的碎片离子很多，对质谱有严重干扰，因此需对三聚氰胺进行衍生化，降低背景化学噪音带来的影响，该方法可进行确证检测，且灵敏度高，但前处理过程复杂，需进行衍生化处理。由于LC-MS/MS法具有灵敏度高、选择性好、定性定量准确，抗干扰能力强等优点，因此最常作为三聚氰胺残留检测的标准法。但该方法也存在前处理过程复杂，耗时比较长、成本高等缺点。免疫分析法是以抗原和抗体的特异性、可逆性结合为基础，对动物性食品中药物或有害化合物残留进行定量及半确证的方法。本专利技术的化学发光法与传统酶联免疫法相比，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、没有酶免疫物OPD或TMB的致癌作用等优点。检测时样品中的三聚氰胺将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗三聚氰胺抗体，加入酶标二抗工作液和化学发光底物液后，用化学发光仪测量微孔的光子数，将未知样品的读数和标准品的读数比较，就能得到样品中的三聚氰胺的浓度。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种三聚氰胺半抗原、抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用。本专利技术提供的三聚氰胺半抗原，为式Ⅰ所示的化合物；式Ⅰ。本专利技术还公开了式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：①2-氯-4,6二氨基三嗪100mg溶于10ml乙醇；②130mg4-氨基苯甲酸钠溶于10ml0.1mol/L碳酸氢钠溶液后，缓慢加入上述溶液，混匀，70℃搅拌反应24h；③0.1mol/L盐酸调pH为6，过滤，固体少量水洗，真空干燥得到三聚氰胺半抗原。本专利技术提供的三聚氰胺抗原，是将式Ⅰ所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等。所述式Ⅰ所示化合物与BSA偶联得到的三聚氰胺抗原的结构见图1。本专利技术还公开了所述三聚氰胺抗原制备的方法，包括如下步骤：①40mg三聚氰胺半抗原溶于5mlN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰浴中加入三正丁胺38μl，搅拌反应10min，加入氯甲酸异丁酯22μl，室温反应1h；②BSA100mg溶于10ml0.1mol/L碳酸钠溶液，将活化三聚氰胺半抗原溶液逐滴加入，室温搅拌过夜，PBS（pH7.4）4℃透析72h，期间换透析液6次；③将透析产物在无菌条件下通过0.2μm的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。所述三聚氰胺抗原可以作为免疫原制备三聚氰胺特异性抗体，也可以作为包被原制备化学发光免疫微孔板。应用三聚氰胺抗原制备得到的特异性抗体具体可为单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术还公开了应用三聚氰胺抗原和三聚氰胺特异性抗体制备得到的化学发光免疫试剂盒，包括包被有所述偶联物的化学发光微孔板（偶联物作为包被原）。所述试剂盒还可包括以所述偶联物为免疫原得到的抗体。所述抗体具体可为兔源单克隆抗体。所述“包被有所述偶联物的化学发光微孔板”的制备方法具体如下：（1）取所述偶联物，用包被缓冲液稀释（包被缓冲液具体可为pH9.6、0.03M的碳酸盐缓冲液），得到包被原稀释液（蛋白浓度具体可为2ng/mL）；（2）将包被原稀释液加入化学发光微孔板（具体可100μL/孔），孵育（具体可37℃孵育16小时），洗涤，拍干；（3）完成步骤（2）后，进行封闭（每孔可加入200μL封闭液，37℃温育2h；封闭液的具体配方：将10g牛血清白蛋白、0.1mLproclin300和1000mLpH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲液混合，得到封闭液），倾去孔内的液体，干燥。本专利技术还保护所述试剂盒在检测待测样本中是否含有三聚氰胺中的应用。本专利技术依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样品中微量小分子目标分析物。本专利技术制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本专利技术克服了现有检测技术中对三聚氰胺样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本专利技术的三聚氰胺抗原，通过免疫动物可产生了针对三聚氰胺的特异性抗体，用于快速检测食品中的三聚氰胺残留，具有操作简单、快速，处理样品量大，灵敏度高，特异性强等诸多优点。附图说明图1为三聚氰胺半抗原质谱图。图2为三聚氰胺半抗原核磁共振图。图3为三聚氰胺化学发光免疫检测试剂盒标准曲线图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、三聚氰胺半抗原的制备与鉴定一、三聚氰胺半抗原的制备方法，具体操作步骤包括：①2-氯-4,6二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三聚氰胺半抗原，为式Ⅰ所示化合物：式Ⅰ。

【技术特征摘要】
1.一种三聚氰胺半抗原，为式Ⅰ所示化合物：
式Ⅰ。
2.式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
2-氯-4,6二氨基三嗪100mg溶于10ml乙醇；
130mg4-氨基苯甲酸钠溶于10ml0.1mol/L碳酸氢钠溶液后，缓慢加入上述溶液，混匀，70℃搅拌反应24h；0.1mol/L盐酸调pH为6，过滤，固体少量水洗，真空干燥得到三聚氰胺半抗原。
3.一种三聚氰胺抗原，是将式Ⅰ所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。
4.根据权利要求3所述三聚氰胺抗原，其特征在于，所述载体蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白。
5.权利要求3或4所述的三聚氰胺抗原的制备方法，包括如下步骤：
40mg三聚氰胺半抗原溶于5mlN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰浴中加入三正丁胺38μl，搅拌反应10min，加入氯甲酸异丁酯22μl，室温反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文珺，吴小平，王照鹏，温凯，陈银辉，邢佑尚，张桂亮，金兴，邱检萍，胡蒙蒙，姚琳，韩京朋，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11