一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法技术

本发明专利技术属于食品安全免疫学检测技术领域，具体公开一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法，所述方法包括：（1）对复杂基质进行预处理；（2）使用免疫亲和柱提取预处理样品中的五氯苯酚；（3）采用HPLC

【技术实现步骤摘要】
一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法


[0001]本专利技术属于食品安全免疫学检测
，具体涉及一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法。

技术介绍

[0002]五氯苯酚(pentachloropHenol，PCP)及其钠盐五氯酚钠(sodium pentachloropHenol，PCP
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Na)属于氯代芳香族化合物，其化学结构稳定，不易降解，可在环境中持续存在并在人体内蓄积。五氯苯酚在获得广泛应用的同时，其所造成的环境及健康问题也引起人们高度重视。流行病学研究与体内外实验发现，五氯苯酚可导致肝、肾、中枢神经系统损伤及内分泌功能紊乱，并且具有强烈的致癌、致畸变作用。
[0003]现有研究表明，五氯苯酚可通过呼吸、摄食或直接接触等多种途径进入人体，并蓄积于肝脏、肾脏及脂肪等组织，导致人体的高暴露风险。开展五氯苯酚的人体生物监测是评估人体暴露水平和健康风险的有效手段。国内外研究者基于固相萃取、气相色谱
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串联质谱法及液相色谱
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串联质谱法等建立了血液、尿液等常规生物样本中五氯苯酚的分析技术并成功应用于大规模的人群暴露监测。
[0004]与血液和尿液相比，母乳是另一种较为理想的人体生物检测基质，具有易于收集、无损伤性和富含脂肪等特点，更适用于脂溶性有机污染物的人体蓄积评估。同时，母乳作为婴儿生命早期最理想的天然食品，分析母乳中的五氯苯酚水平既能够反应母亲的暴露水平又能够评估婴儿的健康风险。但是， 母乳基质较血液、尿液等样本更为复杂，对样品前处理方法的净化能力要求更高。为此，有必要针对母乳中残留的五氯苯酚进一步开发简便准确、净化能力强的分析技术，为开展母婴暴露水平的监测提供方法学基础，同时也可为开展血液、尿液等其他人体样本的暴露水平监测提供方法学参考。
[0005]目前，母乳中五氯苯酚及五氯酚钠的检测主要采用气相色谱
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串联质谱法。然而，五氯苯酚分子结构中的5个氯原子的作用使得其极性较强，在气相色谱柱上较难洗脱，存在色谱峰拖尾，检测灵敏度较低等不足。液相色谱
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串联质谱法测定五氯苯酚方法简便、灵敏度高，但容易受到基质抑制作用影响。针对这一问题，本研究拟采用基于抗原抗体特异性可逆结合原理的免疫亲和柱(immunoaffinity column，IAC)从复杂的母乳样品中高选择性地提取五氯苯酚，以达到降低基质效应的目的。前期研究发现，基于免疫亲和柱的样品净化方法还具有回收率高、操作便捷等优点，适用于大批量样品的快速检测。
[0006]专利文献CN105462933A与CN101526525A分别公开了一株五氯苯酚单克隆抗体杂交瘤细胞株和用于五氯酚残留分析的酶联免疫吸附试剂盒，其中用于制备所述五氯苯酚单克隆抗体的半抗原均是对羟基四氯苯氧丁酸。期刊文献（“Development of an enzyme
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linked immunosorbent assay for the detection of pentachloropHenolresidues in water samples”， Food and Agricultural Immunology， 2007， 18(3
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4)，189
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201）也报道了半抗原对羟基四氯苯氧丁酸，其结构式如下：
；但是该半抗原所制得单克隆抗体灵敏度还有待进一步提升。

技术实现思路

[0007]基于此，本专利技术的目的是建立一种基于免疫亲和柱净化，高效液相色谱
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串联质谱法(HPLC
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MS/MS)精准定量的分析方法，简便高效地检测母乳中五氯苯酚残留量，为进一步开展人群健康风险评估提供技术支撑。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法，所述方法包括：（1）对复杂基质进行预处理；（2）使用免疫亲和柱提取预处理样品中的五氯苯酚；所述免疫亲和柱由偶联五氯苯酚单克隆抗体的柱料制备得到，制备所述五氯苯酚单克隆抗体使用的半抗原结构式如下：(I)；（3）采用HPLC
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MS/MS方法对五氯苯酚进行测定。
[0009]优选的，所述步骤（1）的预处理方法包括：向所述复杂基质中加入8
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10倍体积的提取液超声提取20
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30min；离心，取上清液；氮气流吹至1
‑
2 mL，加入PBS混匀备用；所述提取液为50
‑
90vol.%甲醇水溶液或50
‑
90 vol.%乙腈水溶液，且所述甲醇水溶液或乙腈水溶液中含有1
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5 wt.%的甲酸或三乙胺。
[0010]优选的，所述提取液为70
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90 vol.%乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中含有3
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5wt.%的三乙胺。
[0011]在本专利技术的最优选实施方式中，所述提取液是70 vol.%乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中含有5wt.%的三乙胺。
[0012]本专利技术所述的“vol.%”表示体积百分数，“wt.%”表示质量百分数。
[0013]本专利技术所述的复杂基质是任何可能含有五氯苯酚的基质，包括但不限于尿液、血液、母乳、牛乳、羊乳。
[0014]在本专利技术的优选实施方式中，所述复杂基质为母乳。
[0015]本专利技术提供一种母乳样品预处理的方法，所述方法具体为：准确吸取母乳样品1 mL，加入8 mL含5 wt.%三乙胺的乙腈
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水溶液(7:3, V/V)，涡旋均匀后超声提取20 min，4℃ 10000 r/min条件下离心10 min，吸取上清液并置于15 mL离心管中，在35℃下经温和氮气流吹至2 mL，加入10 mL 2
×
PBS缓冲液，涡旋混匀备用。
[0016]本专利技术步骤（2）所述的免疫亲和柱通过如下方法制备得到：步骤一：向NHS活化柱料中加入PBS进行柱料洗涤；步骤二：将洗涤后的活化柱料与五氯苯酚单克隆抗体按照1:1
‑
2（v:m）混合，搅拌反应12
‑
24h，PBS洗涤；步骤三：将步骤二制备的偶联五氯苯酚单克隆抗体的柱料与空白柱料按照体积比1:2
‑
3混合，装柱，4℃保存备用。
[0017]进一步，本专利技术所述的五氯苯酚单克隆抗体通过如下方法制备得到：A：式(I)所示的半抗原与载体蛋白偶联制备全抗原；B：根据全抗原制备得到五氯苯酚单克隆抗体。
[0018]所述载体蛋白可为牛甲状腺球蛋白（BTG）、牛血清白蛋白（BSA）、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白。
[0019]步骤B所述的根据全抗原制备得到五氯苯酚单克隆抗体是本领域的常规操作，本专利技术不做限定。在本专利技术的具体实施方式中，根据全抗原制备五氯苯酚单克隆抗体的方法包括：（1）小鼠的免疫：全抗原与等体积弗氏佐剂混合免疫BALB/c小鼠，首次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复杂基质中痕量五氯苯酚的检测方法，所述方法包括：（1）对复杂基质进行预处理；（2）使用免疫亲和柱提取预处理样品中的五氯苯酚；所述免疫亲和柱由偶联五氯苯酚单克隆抗体的柱料制备得到，制备所述五氯苯酚单克隆抗体使用的半抗原结构式如下式(I)：
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(I)；（3）采用HPLC
‑
MS/MS方法对五氯苯酚进行测定。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）的预处理方法包括：向所述复杂基质中加入8
‑
10倍体积的提取液超声提取20
‑
30min；离心，取上清液；氮气流吹至1
‑
2 mL，加入PBS混匀备用；所述提取液为50
‑
90 vol.%甲醇水溶液或50
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90 vol.%乙腈水溶液，且所述甲醇水溶液或乙腈水溶液中含有1
‑
5 wt.%的甲酸或三乙胺。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述提取液为70
‑
90 vol.%乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中含有3
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5wt.%的三乙胺。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的免疫亲和柱通过如下方法制备得到：步骤一：向NHS活化柱料中加入PBS进行柱料洗涤；步骤二：将洗涤后的活化柱料与五氯苯酚单克隆抗体按照1:1
‑
2体积质量比，单位mL：mg，混合，搅拌反应12
‑
24h，PBS洗涤；步骤三：将步骤二制备的偶联五氯苯酚单克隆抗体的柱料与空白柱料按照体积比1:2
‑
3混合，装柱，4℃保存备用；所述的五氯苯酚单克隆抗体通过如下方法制备得到：A：式(I)所示的半抗原与载体蛋白偶联制备全抗原；B：根据全抗原制备得到五氯苯酚单克隆抗体；所述载体蛋白可为牛甲状腺球蛋白、牛血...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵兵，尹杰，韩沐珂，马立才，丁亚芳，覃丹凤，秦誉，贾良曦，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：