红霉素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种红霉素半抗原和人工抗原，分子结构式分别为：本发明专利技术还公开了此半抗原、人工抗原和以此抗原制备的抗体的制备方法，以及半抗原、抗体的用途。本发明专利技术最终制成的抗体检测灵敏度高、特异性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及选择一种具有—COOH的、又最大可能包含红霉素原有结构的化合物作为红霉素半抗原，以此半抗原制成的人工抗原、特异性抗体；以及此类半抗原、人工抗原、特异性抗体的用途，和半抗原、人工抗原、抗体的制备方法。
技术介绍
红霉素(ErythromycinA)属大环内酯类抗生素，对葡萄球菌、各种链球菌和革兰氏阳性杆菌均具有抗菌活性，主要用于抗畜禽细菌及支原体感染，亦可用作猪的饲料添加剂以促进增重和提高饲料转换率，在畜禽、水产品养殖及其疾病治疗过程中应用广泛。但是红霉素能对机体产生一些副作用，如胃肠道反应、胆汁郁积性黄疸以及静滴时引起静脉炎，还能引起坏死性肝病、精神障碍和关节炎综合症等，因此，红霉素在生产上的大量使用会由于其在动物体内代谢时间较长而在畜禽组织、蜂蜜、牛奶、鱼虾等产品中的残留，危害公众健康。目前世界各国为保证食品安全，对红霉素的使用和红霉素在食品中的残留限量进行了规定，我国农业部235号公告中规定红霉素的最大残留限量为动物组织200μg/kg，奶40μg/kg，蛋150μg/kg。目前对红霉素的研究主要集中在医药领域，食品中红霉素残留的相应检测方法研究报道较少，且多为仪器检测，如薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等。仪器检测法存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，所以在我国无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。酶联免疫吸附测定技术Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay(ELISA)，是将免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量的测定方法，具有成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单的特点，适合大批量样品的快速分析。而免疫学检测方法的基础是相应的高特异性、高亲和力的抗体的制备，而红霉素作为小分子化合物，本身不具备免疫原性，因此，其半抗原的结构改造和全抗原合成是建立免疫速测技术的关键和难点之一。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种能最大程度保留红霉素的化学结构，又具有一定长度连接臂的半抗原以及这种半抗原的制备方法；以此半抗原制备的人工抗原、检测灵敏度高和特异性强的抗体；以及此半抗原、抗体的用途。本专利技术为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种红霉素半抗原，它的分子结构式为：本专利技术的半抗原以红霉素为起始原料，先与溴乙酸叔丁酯反应生成中间体，再与甲酸反应生成羧甲基红霉素，即为红霉素半抗原。反应式如下：本专利技术的红霉素半抗原的制备方法进一步描述如下：1)向100mL两口烧瓶中加入0.5g溴乙酸叔丁酯、0.90g红霉素和10mL丙酮，加热至轻微回流，反应20h后，抽滤白色固体；2)向步骤1)所得固体粉末中加入10mL四氢呋喃和10mL甲酸，室温反应20h，蒸除溶剂得到羧甲基红霉素，即为红霉素半抗原。上述方法制得的红霉素半抗原，具有红霉素特征结构的同时又具有可以与蛋白质偶联的—COOH结构。本专利技术还提供了一种依靠上述红霉素半抗原制得的红霉素人工抗原，它的分子结构式为：本专利技术的红霉素人工抗原的制备方法描述如下：1)18mg红霉素半抗原溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺中；2)30mg碳化二亚胺和30mgN-羟基琥珀酰亚胺用0.2mL水充分溶解后加入到步骤1)红霉素半抗原溶液中，室温搅拌24h；3)50mg载体蛋白充分溶于3.8mLPBS(pH7.2)中，将步骤2)所得溶液逐滴缓慢加入到蛋白溶液中，室温搅拌24h；4)待上述反应完成后，装入透析袋中，0.01mol/LPBS缓冲液中4℃透析3d，每天换透析液3次，透析完成后冻干，-20℃保存备用。所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)，优选牛血清白蛋白(BSA)。本专利技术还提供了一种红霉素特异性抗体，是用分子结构式为的红霉素人工抗原免疫白鼠所得到的、能与红霉素发生特异性免疫反应的单克隆免疫球蛋白G。本专利技术同时提供了上述红霉素半抗原的用途，是用作动物免疫的抗原体系的原料。本专利技术同时提供了上述红霉素特异性抗体的用途，用于检测食品中红霉素类化合物的残留量。所述红霉素类化合物为红霉素、硫氰酸红霉素和琥乙红霉素中的至少一种。基于红霉素内酯环结构可能是其活性官能团，以红霉素为原料，经过两步反应，分别与溴乙酸叔丁酯、甲酸反应，引入不同的“连接臂”合成了半抗原，最大可能保留了原来红霉素的分子结构，使红霉素分子的化学结构与电子分布几乎不受影响，这为获得对红霉素有高度特异性的抗体提供了保证。本专利技术中合成的红霉素半抗原化合物为国内外首创的新化合物，既最大程度地保留了红霉素的化学结构，又具有一定长度的连接臂，用这一半抗原制备的免疫抗原去免疫动物，所得的抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，所得的抗体用于ELISA方法检测红霉素类化合物，灵敏度可达0.2μg/L，与其他大环内酯类抗生素的交叉反应率低。附图说明图1红霉素半抗原合成路线图图2红霉素半抗原核磁共振氢谱图图3红霉素ELISA竞争标准曲线图具体实施方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本专利技术。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1：半抗原合成和鉴定一种红霉素半抗原，分子结构式为：是用作动物免疫的抗原体系的原料。上述红霉素半抗原的制备方法如下(合成路线见附图1)：1)向100mL两口烧瓶中加入0.5g溴乙酸叔丁酯、0.90g红霉素和10mL丙酮，加热至轻微回流，反应20h后，抽滤白色固体；2)向步骤1)所得固体粉末中加入10mL四氢呋喃和10mL甲酸，室温反应20h，蒸除溶剂得到羧甲基红霉素，即为红霉素半抗原。产物的鉴定：取上述目的产物经核磁共振氢谱鉴定，见附图2所示。图谱中11.0ppm增加的羧基峰说明红霉素半抗原合成成功。实施例2：人工抗原合成和鉴定由实施例1所述红霉素半抗原制成的一种红霉素人工抗原，分子结构式为：1、免疫原的合成免疫原的合成利用碳化二亚胺法，制备方法如下：1)18mg红霉素半抗原溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺中(DMF)；2)30mg碳化二亚胺(EDC)和30mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)用0.2mL水充分溶解后加入到步骤1)红霉素半抗原溶液中，室温搅拌24h；3)50mg牛血清白蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红霉素半抗原，其特征在于它的分子结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种红霉素半抗原，其特征在于它的分子结构式为：
2.一种权利要求1所述红霉素半抗原的制备方法，其特征在于依次包括下列步骤：
1)向100mL两口烧瓶中加入0.5g溴乙酸叔丁酯、0.90g红霉素和10mL丙酮，加热至轻
微回流，反应20h后，抽滤白色固体；
2)向步骤1)所得固体粉末中加入10mL四氢呋喃和10mL甲酸，室温反应20h，蒸除
溶剂得到羧甲基红霉素，即为红霉素半抗原。
3.一种红霉素人工抗原，其特征在于它的分子结构式为：
4.一种权利要求3所述红霉素人工抗原的制备方法，其特征在于依次包括下列步骤：
1)18mg红霉素半抗原溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺中；
2)30mg碳化二亚胺和30mgN-羟基琥珀酰亚胺用0.2mL水充分溶解后加入到步骤1)
红霉素半抗原溶液中，室温搅拌24h；
3)50mg载体蛋白充分溶于3.8mLPBS(pH7.2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯才伟，冯月君，冯才茂，李勇，崔廷婷，吴小胜，杨昌松，冯静，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11