黄病毒疫苗制造技术

一种复制子病毒样颗粒，能用于制备黄病毒疫苗。

【技术实现步骤摘要】
黄病毒疫苗
技术介绍
本专利技术涉及黄病毒科病毒。黄病毒属包括70多种病毒,其中40种与人类疾病有关。大部分黄病毒是虫媒病毒，通过蚊、蜱向鸟和哺乳动物(包括人)等宿主传播。其中，登革热病毒(1-4型)、黄热病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒和西尼罗河病毒能引起人类很高的发病率和死亡率。而另一些黄病毒是重要的兽医病原，如跳跃病病毒能引起绵羊的神经性疾病，西尼罗河病毒能引起马脑炎，日本脑炎病毒能引起马脑炎和猪死产。黄病毒基因组由一条线性的单链正意RNA组成，该正链能感染适合的宿主细胞。全部基因组长10-llkbs,无3’端polyA,5’端有甲基化cap。黄病毒的基因组不含内部核糖体进入部位(IRES，提供一个宿主核糖体翻译起始位点)。它通过核糖体扫描启动蛋白合成。黄病毒颗粒呈球状，直径40-65nm ;外被脂囊膜，内含直径约25_30nm的二十面体衣壳。一般来说，黄病毒由节肢动物传播，如蚊和蜱。黄病毒在其介体内繁殖并通过介体从一个宿主传播到另外一个宿主。黄热病毒能引起大规模疫病流行。它在宿主猴和人以及介体蚊之间传播。一种传播途径是病毒通过非洲伊蚊(Aedes africanus)和其它伊蚊(在非洲)、或Hemogogus蚊(在美洲)传播，猴作为储存宿主，深入森林或丛林的人常被感染。另一种传播途径是通过与人类生活密切相关的家蚊——埃及伊蚊，直接将病毒传播到人，此途径只有一个宿主。蜱传脑炎病毒由俄罗斯和欧洲温带的硬蜱传播。病毒只在硬蜱存在的地区感染人类。 黄病毒能引起其它类型的脑炎,如墨累谷脑炎(Murray Valley encephalitis)、罗西奥脑炎(Rocio encephalitis)和玻瓦桑脑炎(Powassan encephalitis),以及最近多在北美流行的西尼罗河热病。登革热是一种急性传染病，其典型特征是两阶段发热，头疼，全身疼痛，疲劳，皮疫，淋巴结肿大和白细胞减少(Holstead, SB, 1980, Immunological parametersoftogavirus disease syndromes, p.107-173, in Rff Schlesinger (ed.)TheTogaviruses,Academic Press, Inc., NY ；Sabin, AB,1959, Dengue, p.361-373, in T Rivers and FHorsfall (eds.), Viral and Rickettsial Infections of Man, JB Lippincott C0.,Philadelphia).登革热由蚊子传播，由四种血清学相关的登革病毒类型(登革I型-4型)感染引起。一种登革病毒血清型的感染能提供该亚型病毒的终生免疫，但不能形成对其它亚型病毒的交叉免疫保护。也就是说，生活在登革热疫区的人在其一生中可能感染3种甚至是4种亚型的登革病毒。症状从无明显感染到典型的登革热，在一些严重的病例中，还出现可能致命的登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)。登革出血热(DHF)是一种严重的热病，其特征是止血异常、血管通透性增加，有时能导致血量减少性休克综合征，即登革休克综合征(DSS) (World HealthOrganization:1975.Technical Guides for Diagnosis，Treatment，Surveillance, Prevention andControl of Dengue Hemorrhagic Fever.WorldHealth Organization.Geneva).在不同的病例中DHF/DSS的机理可能不同。主要因素可能包括病毒毒性，患者健康状况和不同血清型登革病毒的二次感染。基于对黄病毒疫苗的迫切需求，需要建立新的疫苗方案。理论上，活的弱毒疫苗能刺激最有效、持久且病毒特异性的免疫，而灭活病毒疫苗，包括重组亚单位疫苗，能提供最高水平的安全性。理想的疫苗应能产生活疫苗的效力和亚单位疫苗的安全性。本专利技术的目标是发展一种假传染性病毒样颗粒(PVLP)疫苗。专利技术概要本专利技术涉及制造一种黄病毒疫苗的材料和方法。该疫苗由病毒样颗粒组成，能感染宿主细胞，在宿主细胞中复制并合成可被宿主免疫系统识别的病毒蛋白，但不能包装成感染性病毒颗粒。该病毒样颗粒包含一个复制子，该复制子含有所有能确保复制子RNA自我复制和黄病毒蛋白合成所需的基因。所以，优选的复制子应含有所有的非结构蛋白基因和preM、E基因。但其衣壳基因需要处理，以确保不能合成衣壳蛋白，或合成后无法用于形成感染性病毒颗粒，同时保证preM、E蛋白的高水平表达。本专利技术所述的病毒样颗粒能感染宿主细胞，然后在细胞中合成多拷贝的复制子，继而由复制子表达preM、E蛋白。preM、E蛋白由宿主细胞释放或被表达在细胞表面，进而激发宿主的体液和细胞免疫发应。本专利技术的其它特征和优点将在以下的专利技术细节描述和附图中被解释和展示。附图说明图1显示了黄病毒的结构。图2显示了黄病毒的基因组结构以及多聚蛋白的翻译和加工位点。图的上部显示了病毒的基因组结构，包括结构蛋白和非结构蛋白编码区，5’cap，假定的3’二级结构，以及5’和3’非翻译区(NTR)。基因组下面的图显示了由蛋白水解加工产生的前体蛋白和成熟蛋白。成熟结构蛋白用阴影框标识，非结构蛋白和结构蛋白的前体用白框标识，连续的无电荷氨基酸区用黑条标识。星号*指示带有N多糖的蛋白，但不表明其位置和数量。图中还标识了蛋白酶的剪切位点。ORF指开放阅读框架。图3显示了登革病毒基因组及其衍生的复制子。复制子DEN2/AprM-E由基因组删除PrM蛋白和E蛋白(452nt-2340nt)而成。复制子DEN2/A C_prM_E由基因组删除了157nt-2340nt而成。复制子DEN2/A C由基因组删除了 160nt_320nt而成。UCR指非编码区。图4显示了用穿梭载体系统获得全长黄病毒cDNA克隆的技术方案。TRP代表磷酸核糖-氨基苯甲酸异构酶，一种酵母的选择标记基因；2um表示来自质粒的酵母复制起点；amp指氨节青霉素抗性基因；ori表示细菌复制起点。RT-PCR指反向转录酶聚合酶链反应。图5显示了 NS3缺失的黄病毒亚基因组表达质粒结构。CMV指巨细胞病毒启动子。UTR指非翻译区。HDVr将在下 文解释。Neo指新霉素抗性基因。PA指聚腺苷酸化位点。图6显示了构建体生成的方案。pTet-off质粒被用于生产第一个稳定细胞株BHK/Tet-off,该细胞株能自调控表达四环素转录激活因子(tetracyclinetransactivator,tTA)。TRE指四环素反应因子。Pminaw指最小化的CMV启动子。tTA指四环素转录激活因子。IRES指脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点。Hyix)指潮霉素B磷酸转移酶基因。Neo指新霉素磷酸转移酶基因。Intron指在Clontech某载体中一段合成序列。Cpr指含有衣壳蛋白和部分PrE片段的多肽。专利技术的具体描述黄病毒颗粒由6% RNA、66%蛋白、9%多糖和17%脂组成(Russell PK, BrandtWE,Dalrymple JM，Chemical and Antigenic S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经改造的黄病毒基因组复制子，其特征在于，所述复制子不含转基因，并且表达黄病毒的囊膜蛋白(E)、前膜蛋白(prM)和/或膜蛋白(M)的至少一种免疫决定簇，不表达C蛋白或者表达的C蛋白不能用于形成感染性病毒所需的功能性衣壳。

【技术特征摘要】
2004.07.12 US 60/586,7221.一种经改造的黄病毒基因组复制子，其特征在于，所述复制子不含转基因，并且表达黄病毒的囊膜蛋白(E)、前膜蛋白(prM)和/或膜蛋白(M)的至少一种免疫决定簇，不表达C蛋白或者表达的C蛋白不能用于形成感染性病毒所需的功能性衣壳。2.根据权利要求1所述的复制子，其特征在于，所述复制子为经改造的登革病毒基因组复制子，并且由登革病毒基因组删除了 160nt-320nt而成。3.一种非复制型黄病毒颗粒，其特征在于，所述黄病毒颗粒含有权利要求1或2所述的复制子。4.根据权利要求3所述的非复制型黄病毒颗粒，其特征在于，所述黄病毒为登革病毒。5.根据权利要求3或4所述的非复...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞小伍，顾心彬，
申请(专利权)人：美国天甲生物医药有限公司，上海天甲生物医药有限公司，北京东方天甲科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：