本发明专利技术属于生物基因工程领域，要解决现有技术中的治疗猪乙脑的疫苗病毒滴度低、保持能力不佳的技术问题。提供了一种融合蛋白，由乙脑E蛋白C末端的中和表位基因和M.Thsp70基因构成，本发明专利技术还提供了含有上述融合蛋白基因的载体，含有上述蛋白的疫苗以及上述载体的制备方法，载体的制备方法是先合成乙脑E蛋白C末端的中和表位基因，将中和表位基因克隆入原核表达载体，然后以人结核杆菌H37Rv标准株的基因组为模板扩增出M.Thsp70基因，将hsp70基因克隆入原核表达载体，从而得到融合蛋白表达载体，再纯化获得表达蛋白，制备用于预防乙脑的疫苗。本发明专利技术疫苗的中和抗体效价高于弱毒苗，易于大规模、高效、快速生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程领域，尤其涉及一种含有乙脑E蛋白C末端中和表位基因的融合蛋白及其疫苗。
技术介绍
猪是乙脑主要的传染源之一，它与蚊形成了“蚊、猪”的循环传播模式。同时，乙脑也是严重危害养猪业的重大疫病之一，该病引起妊娠母猪流产和死胎，公猪发生睾丸炎，仔猪因脑炎病死，直接影响猪群数量的扩大，给养猪业的持续高产发展造成了巨大的经济损失，并极大的限制了肉产品的出口创汇；在我国目前用于猪乙脑治疗的疫苗是BHK细胞上培养的弱毒苗，但是存在病毒滴度低，保持能力不佳等缺点，所以对研制乙脑基因工程疫苗的要求越来越迫切；乙脑病毒的结构蛋白有C、PrM/M和E蛋白三种。E蛋白是病毒的包膜蛋白，含有病毒的抗原决定簇，由500个aa残基组成，分子量为53kDa。E蛋白是疏水性的，富含有甘氨酸和丙氨酸，仅有一个糖基化位点(Asnl54-X-Ser)。E蛋白是毒粒表面的重要成份，由它形成的表面抗原决定簇，具有血凝活性和中和活性。E蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关。E蛋白C末端的中和表位位于E蛋白上373aa_399aa，共27个氨基酸，已研究发现，用该表位的原核表达产物免疫小鼠后，其中和抗体滴度虽然比疫苗或亚病毒颗粒免疫后的滴度低，但是从中和表位免疫小鼠以及疫苗免疫后的中和抗体滴度与ELISA抗体滴度的比值进行比较，表明该中和表位具有很大的潜力，并且在六种毒株(Ja0ArS982, Nakayama, Bei jing-1, Kamiyama,691004 和Muar)之间该部位相当保守，同源性达到85%-100%。专利技术内容针对现有技术中存在的治疗猪乙脑的疫苗病毒滴度低，保持能力不佳的缺陷，本专利技术提供了一种含有乙脑E蛋白C末端中和表位基因的融合蛋白及其疫苗，本专利技术的疫苗中和抗体效价高于弱毒苗，足以保护强毒的攻击。本专利技术提供了一种分离的乙脑E蛋白C末端的中和表位基因，其基因序列如SEQID NO 1 所示。本专利技术还提供了一种上述基因编码的分离的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N02所示。本专利技术还提供了一种融合蛋白，由乙脑E蛋白C末端的中和表位基因和M. T hsp70基因构成，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。本专利技术还提供了一种编码上述融合蛋白的基因，其基因序列如SEQ ID NO :3所示。本专利技术还提供了一种载体，含有SEQ ID NO :1或者SEQ ID NO :3所示的基因序列。本专利技术还提供了一种工程菌，含有SEQ ID NO :I或者SEQ ID NO 3所示的基因序列。进一步的，所述的载体的基因序列如SEQ ID N0:5所不。进一步的，上述载体表达的蛋白的氣基酸序列如SEQ ID N0:6所不。本专利技术还提供了一种用于预防乙脑的疫苗，含有上述的蛋白。本专利技术还提供了一种用于预防乙脑的疫苗，含有上述的工程菌。本专利技术还提供了上述的载体的制备方法，包括一个人工合成乙脑E蛋白C末端的中和表位基因的步骤，一个将中和表位基因克隆到原核表达载体上的步骤，一个扩增hsp70基因的步骤，一个将hsp70基因克隆入原核表达载体中中和表位基因下游，得到融合蛋白表达载体的步骤，一个将融合蛋白表达载体在大肠杆菌中的表达的步骤，一个将表达的蛋白纯化的步骤。进一步的，在一个人工合成乙脑E蛋白C末端的中和表位基因的步骤中，以SEQ IDNO :7所示的序列为正义链，以SEQ ID NO :8所示的序列为反义链,合成乙脑E蛋白C末端 的中和表位基因。进一步的，在一个将中和表位基因克隆到原核表达载体上的步骤中，将中和表位基因以EcoR I和Hind III酶切后，克隆到原核表达载体pET-32a ( + )上，构建表达载体pet-32a_epitope0进一步的，在一个扩增出hsp70基因的步骤中，以人结核杆菌H37Rv标准株的基因组为模板，扩增出hsp70基因，扩增M. T hsp70的上游引物序列如SEQ ID NO 9所示，下游引物序列如SEQ ID NO 10所示。本专利技术根据大肠杆菌偏嗜性密码子原则，人工合成了乙脑E蛋白C末端的中和表位，在大肠杆菌中获得了较高的表达量。本专利技术应用M. T hsp70作为分子佐剂，能增强与其融合表达的抗原肽的免疫反应，起着载体蛋白的作用，可以增强中和表位的免疫原性，在将乙脑的中和表位与hsp70在大肠杆囷中进彳丁融合表达后，将融合蛋白免疫Balb/c小鼠后，其体液免疫和细胞免疫都比单独的中和表位免疫效果好，并且无任何过敏反应，此外，若只是将抗原肽与M. T hsp70进行物理性混合，M. T hsp70是不能发挥它的免疫增强作用的。本专利技术和已有技术相比，其技术效果是显著的，在乙脑病毒的免疫保护机制中，中和抗体足以保护强毒的攻击。在对Balb/c小鼠的免疫试验中，印itope_hsp70融合蛋白的中和抗体效价高于弱毒苗，而且弱毒苗具有生产成本高，效价低，容易返强等缺点；而本专利技术的采用原核表达载体的的基因工程疫苗则不存在上述缺点，而且易于大规模、高效、快速生产，成本低廉。附图说明图I是人工合成乙脑E蛋白C末端的中和表位的设计示意图。图2是重组表达载体pet-32a_epitope的构建示意图,用于表达E蛋白上的中和表位。图3是重组表达载体pet-32a-epitope_hsp70的构建示意图，用于表达E蛋白上的中和表位与hsp70的融合蛋白。图4显示了含pet-32a_印itope的宿主菌经IPTG诱导的SDS-PAGE结果，其中1，2，3代表含pet-32a-印itope的宿主菌的诱导结果；4代表含空载体pET_32a ( + )的宿主菌的诱导结果；5代表中等分子量蛋白质标准。图5显示了含pet-32a_印itope_hsp70的宿主菌经IPTG诱导的SDS-PAGE结果，其中I, 2代表含pet-32a-epitope_hsp70的宿主菌的诱导结果；3代表中等分子量蛋白质标准；4代表含空载体pET-32a ( + )的宿主菌的诱导结果。图6显示了两种重组蛋白的纯化结果以及We stern blot分析，其中I代表pet-32a-epitope_hsp70 纯化后的 SDS-PAGE 分析；2 代表pet-32a_epitope 纯化后的SDS-PAGE 分析；3 代表蛋白质标准Markers ;4代表pet-32a-epitope_hsp70 的 SDS-PAGE分析；5 代表pet-32a-印-itope 的 SDS-PAGE 分析；6 代表pet_32a(+)的 SDS-PAGE 分析；7 代表pet_32a(+)的 Western blot 分析；8 代表pet-32a_epitope 的 Western blot 分析;9 代表:蛋白质标准 Markers ； 10 代表pet-32a-epit-ope_hsp70 的 Western blot 分析；11代表pet-32a(+)的Western blot分析；12代表:蛋白质标准Mark-ers。图7显示了结核杆菌hsp70增强了抗中和表位的Thl反应,e代表以200pmol纯化的重组中和表位；e+white oil代表白油作佐剂的中和表位；e-hsp70代表中和表位与结核本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
2012.03.05 CN 201210053992.51.一种分离的乙脑E蛋白C末端的中和表位基因，其基因序列如SEQ ID N0:1所示。2.权利要求I所述的基因编码的一种分离的蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0:2所示。3.一种融合蛋白，由乙脑E蛋白C末端的中和表位基因和M. T hsp70基因构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。4.一种编码权利要求3所述的融合蛋白的基因，其基因序列如SEQ ID N0:3所示。5.一种载体，其特征在于含有权利要求I或4所述的基因序列。6.一种工程菌，其特征在于含有权利要求I或4所述的基因序列。7.如权利要求5所述的载体，其特征在于其基因序列如SEQID N0:5所示。8.权利要求5所述的载体表达的蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO 6所示9.一种用于预防乙脑的疫苗，其特征在于含有权利要求2或者3所述的蛋白、或者权利要求5所述的载体表达的蛋白。10.一种用于预防乙脑的疫苗，其特征在于含有权利要求6所述的工程菌。11.权利要求5所述的载体的制备方法，其特征在于包括一个人工合成乙...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛菲菲，王建，刘佩红，周锦萍，刘健，杨显超，
申请(专利权)人：上海市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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