本发明专利技术涉及一种基因工程技术领域的诺如病毒P粒子基因PGENE以及在大肠杆菌中表达诺如病毒P粒子的方法，该基因序列为SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，并添加六个组氨酸(6×his)标签，在大肠杆菌中表达诺如病毒P粒子的方法包括：构建含pET32-PGENE基因的表达载体；转化大肠杆菌；pET32-PGENE活性蛋白的提取。本发明专利技术提供的P粒子的免疫原性要强于VLPs，而且P粒子结构稳定，该P粒子作为NVs口服亚基疫苗，在广泛预防Norovirus病毒感染上具有重要应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种基因工程领域人工合成的病毒基因以及在大肠杆菌中表达活性蛋白的方法，具体是根据诺如病毒VA387的P粒子的氨基酸序列合成PGENE基因以及在大肠杆菌中表达诺如病毒P粒子的方法。
技术介绍
Norovirus (NVs)病毒原名为诺瓦克样病毒，NVs是导致人类非细菌性急性胃、肠炎的主要病原，该病毒可以感染各年龄段人群，特别是婴幼儿、老年人和免疫系统缺陷病人属于易感人群。该病毒全年均可发生，冬季属于高发期(Mounts A ff, et al传染病学2000,181(2) :284-287) ；NVs的感染率非常高，感染カ仅次于轮状病毒(Boga J A，et al微生物 诊断2004，42 (6) :2668-2674)。由于NVs属于正义单链RNA病毒(Green K Y，et al传染病学，2000，181 (2) S322-330), NVs基因组易变异，导致其抗原性改变，病毒株得以进化，进而感染易感宿主，给疫情控制上帯来相当大的难度，并且可能出现交叉感染的现象，目前，对NVs疫苗的研究仅局限于病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),通过生产NVs的衣壳蛋白作为其亚基疫苗是NVs疫苗研究的ー个热点。P粒子是NVs衣壳蛋白単体形成12聚体小蛋白分子，VLPs和P粒子均具有免疫原性，ロ服后，均可引起宿主免疫反应，而通过对NVs 的 VLPs 和 P 粒子与人组织血型抗原(human Histo-Blood Group Antigen, HBGA)亲合力研究发现，P粒子的免疫原性要强于VLPs，而且P粒子结构稳定，是研制NVs疫苗更佳候选者。不同NVs毒株与人HBGA的结合存在差异，文献《Hutson A M, et al.传染病学，2002，185(9) :1335-1337》对 8 种 NVs 毒株(I 型的 NV、C59 和 VA115 ；11 型的 VA207、VA387、GrV、MxV和Μ0Η)研究发现，MOH不能识别O血型的HBGA，NV不能识别B血型的HBGA，而VA387可以识别腺体和ABO血型的所有HBGA。由于VA387识别HBGA的广泛性，因此，合成VA387病毒株的衣壳蛋白的PGENE基因，并构建质粒表达载体pET32，从而生产VA387的P粒子作为NVs亚基疫苗，这对今后研制NVs ロ服亚基疫苗提供了一定的參考和借鉴价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供诺如病毒P粒子的基因PGENE，并通过构建质粒表达载体PET32，在大肠杆菌中表达诺如病毒株VA387的P粒子这ー活性蛋白分子的方法。本专利技术提供的P粒子的免疫原性要强于VLPs，而且P粒子结构稳定，该P粒子作为NVs ロ服亚基疫苗，在广泛预防Norovirus病毒感染上具有重要应用价值。本专利技术是通过以下技术方案实现一种诺如病毒P粒子的PGENE基因，其碱基序列如SEQ ID NO. I所示。ー种质粒载体,该载体包括SEQ ID NO. I所示的碱基序列。—种在大肠杆菌中表达诺如病毒P粒子的方法，该方法包括以下步骤步骤一、含目的基因(PGENE基因)表达载体的构建(I)通过生物合成的方法，合成PGENE的核苷酸序列，并将其克隆入pUC57质粒中，命名为 pUC57-PGENE ；(2)用Hind III和BamH I对克隆的pUC57_PGENE质粒载体进行双酶切，获得1029bp的小片段，同时用BamHI和HindIII对pET32a质粒进行酶切；(3)利用胶回收试剂盒分别回收所述PUC57-PGENE酶切产物的小片段DNA分子和所述质粒pET32a酶切产物的大片段DNA分子，用T4连接酶连接所述小片段DNA分子和所述大片段DNA分子，获得重组质粒pET32-PGENE ； (4)将所述重组质粒转化大肠杆菌DH5 α感受态，并在LB液体培养基中培养所述大肠杆菌DH5 α ,然后4°C条件下8000rmp离心5min,取菌体在加有氨节抗生素的LB固体培养基上图板，筛选单菌落，挑取抗性单菌落进行PCR扩增检测和测序检测；(5)将所述单菌落摇菌培养扩增，并抽提其质粒PET32-PGENE，并将该质粒用冻融法导入大肠杆菌BL21中，获得包含目的基因表达载体的大肠杆菌BL21工程菌；步骤ニ、工程菌的培养及P粒子的诱导(I)取所述工程菌于LB液体培养基中，37°C过夜培养，再接着继代培养；(2)取所述继代培养后的菌液进行OD值測定，当OD值达到O. 6-0. 8时，用IPTG进行诱导，所述工程菌即可表达产生诺如病毒P粒子。优选的，所述T4连接酶连接的具体条件为16°C下连接过夜。优选的，在所述LB液体培养基中培养所述大肠杆菌DH5 α的时间为3_5小时。优选的，IPTG诱导的条件为1Μ的IPTG在37°C条件下进行诱导培养4. 5小时。优选的，该方法还包括pET32-PGENE活性蛋白的提取，所述提取包括以下步骤取经IPTG诱导表达后的菌液，4°C条件下8000rmp离心，收集菌落；向所述收集的菌落中加入PBS，超声波破碎细胞；利用NI柱对目的蛋白进行纯化，收集目的蛋白。进ー步优选的，所述超声波破碎的条件为功率200W，超声10s，间隔10s，6个循环。优选的，所述LB液体培养基的组分以及各组分的重量体积百分比为胰化蛋白胨I %，酵母提取物O. 5 %，NaCl I %，羧苄抗生素30 μ g/mL ;所述LB液体培养基的pH值为7.0，所述LB液体培养基经高温高压灭菌25min。优选的，所述LB固体培养基的组分以及各组分的重量体积百分比为胰化蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，羧苄抗生素30μ g/mL，琼脂I. 5% ;所述LB固体培养基的PH值为7. 0，所述LB固体培养基经高温高压灭菌25min。本专利技术提供了诺如病毒P粒子的PGENE基因以及在大肠杆菌中表达诺如病毒P粒子的方法。本专利技术提供的P粒子的免疫原性要强于VLPs，而且P粒子结构稳定，该P粒子作为NVs ロ服亚基疫苗，在广泛预防Norovirus病毒感染上具有重要应用价值。附图说明图I是构建重组质粒时的酶切产物电泳图；图2是胶回收目的片段的电泳检测图；图3是重组质粒载体的鉴定结果图；图4是载体pET32-PGENE克隆载体部分测序结果图；图5是PCR鉴定表达载体转化大肠杆菌BL21的结果图；图6是时间梯度诱导表达的SDS-PAGE电泳检测结果图7是目标蛋白的诱导表达的Western blot检测结果图；图8是目的蛋白的分离纯化结果图；图9是纯化的目的蛋白的western blot检测结果图；图10是ELISA检测小鼠血清效价的比较结果图。具体实施例方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SambiOOk等分子克隆实验室手册' (New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例lpET32_PGENE基因合成及载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种诺如病毒P粒子的PGENE基因，其碱基序列如SEQ ID NO. I所示。2.ー种质粒载体，其特征在于，该载体包括SEQ ID NO. I所示的碱基序列。3.—种在大肠杆菌中表达诺如病毒P粒子的方法，该方法包括以下步骤 步骤ー、合成PGENE基因，并将其连入pUC57质粒中形成质粒载体pUC57_PGENE，用HindIII和BamH I对所述质粒载体pUC57_PGENE进行双酶切，同时用BamH I和Hind III对质粒pET32a进行酶切，利用胶回收试剂盒分别回收所述pUC57-PGENE酶切产物的小片段DNA分子和所述质粒pET32a酶切产物的大片段DNA分子，用T4连接酶连接所述小片段DNA分子和所述大片段DNA分子，获得重组质粒pET32-PGENE ； 步骤ニ、将所述重组质粒转化大肠杆菌DH5 α，并在LB液体培养基中培养所述大肠杆菌DH5ci，然后取该菌体在加有氨苄抗生素的LB固体培养基上图板，筛选单菌落； 步骤三、将所述单菌落摇菌培养扩增，并抽提其质粒PET32-PGENE，并将该质粒用冻融法导入大肠杆菌BL21中，获得包含目的基因表达载体的大肠杆菌BL21工程菌； 步骤四、将所述工程菌在LB液体培养基中先37°C过夜培养，再接着继代培养； 步骤五、取所述继代培养后的菌液进行OD值測定，当其OD值达到O. 6-0. 8时，用IPTG进行诱导，所述工程菌即可表达产生诺如病毒P粒子。4.根据权利要求3所述的在大肠杆菌中表达诺如病毒P粒子的方法，其特征在于，在所述步骤一中，所述T4连接酶连接的具体条件为16°C下连接过夜。5.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵凌侠，杨桂华，王晓磊，李善爽，高美凤，高蕾，赵攀峰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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