一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法技术

本发明专利技术提供一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法，通过检索NCBI 58型HPV病毒基因组序列，获取其E6及E7基因序列信息，以47‑941位点区域构建58型HPV病毒E6及E7致癌基因共同标准品质粒，参照所得目的基因序列，分别在上述位点区域内设计58型HPV病毒E6、E7荧光定量PCR特异性引物，利用所得58型HPV病毒E6/E7共同标准品质粒作为参考品，通过相关检测方案检测细胞样品的58型HPV病毒E6及E7致癌基因绝对定量拷贝数。本发明专利技术可检测HPV‑58病毒E6基因以及E7基因在细胞样品中的拷贝数，并进行绝对定量，从而对细胞的癌变预后以及干预效果判断提供数据支持。

【技术实现步骤摘要】
一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法
本专利技术属于病毒诊断
，具体涉及HPV-58病毒E6/E7致癌基因共同标准对照质粒的构建方案及在细胞样本中E6以及E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法。
技术介绍
人乳头状瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是导致宫颈癌的一个重要因素。宫颈癌在妇科肿瘤中发病率居第2位，全球每年新发病例约50万人，死亡例数约25万人。HPV基因组DNA全长约8kb，包括6个早期基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)开放式阅读框(open-readingframe，ORF)、2个晚期基因(L1、L2)开放式阅读框及1个非编码长控制区(non-codinglongcontrolregion，LCR)，其中，E6、E7基因为两个主要的原癌基因。HPV分为皮肤型和粘膜型2大类。粘膜型HPV主要感染人泌尿生殖道的黏膜上皮，导致与泌尿生殖器官相关的多种疾病。根据与癌症发生的关系大小，粘膜型HPV分为高危型(high-risk，HR)和低危型(low-risk，LR)。高危型主要有HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和66型；而低危型主要有HPV-6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81型。基于分子流行病学和病毒学的研究发现，HPV特别是高危型HPV感染宫颈可发展为宫颈癌，宫颈鳞状细胞癌患者中，58型HPV为其中的一个主要感染亚型，其E6/E7致癌基因的在组织细胞中的拷贝数与肿瘤的发生和发展密切相关。目前，针对人乳头状瘤病毒基因的实验室检测和研究方面主要采用相对定量PCR检测、核酸杂交检测(包括核酸印迹原位杂交、斑点杂交、杂交捕获等)。这些方法可进行HPV分型，实时PCR检测可以初步对病毒拷贝数进行相对定量。值得注意的是，常用的相对定量检测方法由于没有设计病毒拷贝数的标准对照参比品及绝对定量拷贝数计算体系，因而对于细胞样品中病毒绝对拷贝数的具体信息未能知晓，因而不能为后续的研究和结果解读提供足够的信息。
技术实现思路
本专利技术旨在针对58型HPV病毒E6及E7致癌基因构建共同标准品质粒，建立58型HPV病毒E6及E7致癌基因在细胞样品中的绝对定量检测体系，该检测体系的建立既可以通过检测E6基因，又可以通过检测E7基因，快速断定细胞样品是否受到HPV病毒感染，且对细胞样品中中HPV-58型病毒E6及E7致癌基因DNA拷贝数进行绝对定量，从而为细胞样品后续的研究，样品病毒感染情况和癌变可能的预判解读提供足够的信息。本专利技术通过下列技术方案实现：一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法，经过下列各步骤：(1)构建58型HPV病毒E6/E7标准品质粒：a.根据NCBI数据库中58型HPV(GenBank：D90400.1)基因序列，针对E6/E7基因区，按下述设计特异性引物：HPV58E6/E7For：5'-ACGGTCTGACCGAAACCGGTG-3'HPV58E6/E7Rev：5'-ACCTCAAACCAGCCAGTACAG-3'b.HPV-58阳性细胞中总DNA的提取：先将1mLHPV-58阳性细胞保存液吸入1.5mL灭菌的EP管中，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，往沉淀中加入1mLTris-HCl洗涤缓冲液【50mMTris-HCl(pH8.1)，1mMEDTA，0.5％Tween20】，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，再加入1mLTris-HCl洗涤缓冲液，在4℃下以13000rpm离心5min，弃上清；往沉淀中加入200μL浓度为0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液，在50℃下消化过夜；然后以95℃沸水煮沸变性10min；再在4℃下以13000rpm离心5min，将上清转移至0.5mLEP管中，-70℃下冻存，得到58型HPV基因组DNA；c.将步骤(1)b所得58型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物扩增58型HPV病毒E6/E7基因，将扩增产物连接到pMD-18TVector克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，获得58型HPV目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；d.将步骤(1)c所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，获得58型HPV标准品质粒，并用紫外分光光度计测定58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒的浓度，再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：Numberofcopies(copies/μl)＝(Amount×6.022×1023)/(Length×1×109×650)其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量(ng/μl)，Length代表模板DNA长度；(2)参照步骤(1)c所得的58型HPV病毒目的基因序列分别设计下列58型HPV病毒E6和E7的荧光定量PCR特异性引物：HPV58E6For：5'-TGTCAGGCGTTGGAGACATC-3'HPV58E6Rev：5'-ATAGCAATCGTAAGCACACT-3'HPV58E7For：5'-ACCAACTGACCTATTCTGCTATG-3'HPV58E7Rev：5'-ACGTCGGTTGTTGTACTGTTGAT-3'(3)利用步骤(1)d所得58型HPV病毒标准品质粒分别检测细胞样品中的E6和E7致癌基因拷贝数，具体检测方法如下：a.将步骤(1)d所得58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒用双蒸水按梯度稀释至10-7，按PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR检测直接获得58型HPV标准品质粒的扩增曲线与溶解曲线，同时根据荧光定量PCR检测所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数log10作为Y轴绘制58型HPV标准品质粒的标准曲线，进而得到58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒的标准曲线方程：所述PCR反应体系如下：表1荧光定量PCR反应体系(反应总体积为20μl)采用的反应程序如下：b.按步骤(3)a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测细胞样品DNA，分别根据步骤(3)a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程，进而获得细胞样品中HPV病毒E6及E7致癌基因的绝对定量拷贝数。所述步骤(3)a中用双蒸水按梯度稀释至10-7是指将58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒分别用双蒸水稀释成以下梯度：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。本专利技术是通过检索NCBI58型HPV病毒基因组序列，针对58型HPV病毒E6/E7基因，以47-941位点区域构建HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒，即将58型HPV病毒E6/E7基因选定区构建到同一个载体上，建立58型HPV病毒E6/E7致癌基因绝对定量体系，该检测体系的建立既可以通过检测E6基因，又可以通过检测E7基因，快速断定细胞样品是否受到HPV病毒感染，并对细胞样品中HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数进行绝对定量，从而对细胞癌变的预后判断提供数据参考。本专利技术具备的优点和效果：本专利技术是针对58型HPV病毒E6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）构建58型HPV病毒 E6/E7致癌基因共同标准品质粒：a．根据NCBI数据库中58型HPV基因序列，针对E6/E7基因47‑941位点区域，按下述设计特异性引物：HPV58 E6/E7For：5'‑ACG GTC TGA CCG AAA CCG GTG‑3'HPV58 E6/E7Rev：5'‑ACC TCA AAC CAG CCA GTA CAG‑3'b．宫颈癌细胞中总DNA的提取：先将1 mL HPV‑58阳性细胞保存液吸入1.5 mL灭菌的EP管中，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，往沉淀中加入1mL Tris‑HCl 洗涤缓冲液，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，再加入1mL Tris‑HCl洗涤缓冲液，在4℃下以13000rpm离心5min，弃上清；往沉淀中加入200 µL浓度为0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液， 在50℃下消化过夜；然后以95℃沸水煮沸变性10min；再在4℃下以13000rpm离心5min，将上清转移至0.5 mL EP管中，‑70℃下冻存，得到58型HPV基因组DNA；c．将步骤（1）b所得58型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物扩增58型HPV病毒 E6/E7基因，将扩增产物连接到pMD‑18T Vector克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，获得58型HPV目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；d．将步骤（1）c所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，获得58型HPV标准品质粒，并用紫外分光光度计测定58型HPV标准品质粒的浓度，再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：Number of copies（copies/μl） = (Amount×6.022×10...

【技术特征摘要】
1.一种58型HPV病毒E6/E7致癌基因拷贝数的绝对定量检测方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）构建58型HPV病毒E6/E7致癌基因共同标准品质粒：a．根据NCBI数据库中58型HPV基因序列，针对E6/E7基因47-941位点区域，按下述设计特异性引物：HPV58E6/E7For：5'-ACGGTCTGACCGAAACCGGTG-3'HPV58E6/E7Rev：5'-ACCTCAAACCAGCCAGTACAG-3'b．宫颈癌细胞中总DNA的提取：先将1mLHPV-58阳性细胞保存液吸入1.5mL灭菌的EP管中，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，往沉淀中加入1mLTris-HCl洗涤缓冲液，在4℃下以13000rpm离心5min；弃上清，再加入1mLTris-HCl洗涤缓冲液，在4℃下以13000rpm离心5min，弃上清；往沉淀中加入200µL浓度为0.1mg/mL的蛋白酶K裂解液，在50℃下消化过夜；然后以95℃沸水煮沸变性10min；再在4℃下以13000rpm离心5min，将上清转移至0.5mLEP管中，-70℃下冻存，得到58型HPV基因组DNA；c．将步骤（1）b所得58型HPV基因组DNA通过PCR的方法，利用步骤a的特异性引物扩增58型HPV病毒E6/E7基因，将扩增产物连接到pMD-18TVector克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，获得58型HPV目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；d．将步骤（1）c所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，获得58型HPV标准品质粒，并用紫外分光光度计测定58型HPV标准品质粒的浓度，再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：Numberofcopies（copies/μl）=(Amount×6.022×1023)/（Length×1×109×650）其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量（ng/μl），Length代表模板DNA长度；（2）参照步骤（1）c所得的58...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙强明，席珏敏，陈俊英，潘玥，王晓丹，姜黎明，罗佳，杨佳佳，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53