本发明专利技术涉及miR‑21在制备EnMSCs旁分泌作用调节剂中的应用，以及一种调节EnMSCs旁分泌作用的培养方法。本发明专利技术证实miR‑21表达下调之后会减弱EnMSCs的旁分泌保护作用，本发明专利技术提供了miR‑21在制备EnMSCs旁分泌作用调节剂中的应用，通过miR‑21‑KD，可有效抑制EnMSCs的外泌体对于心肌细胞的抗凋亡和HUVECs的血管新生的作用，从而证实其对于EnMSCs的调控作用。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及miR-21在制备EnMSCs旁分泌作用调节剂中的应用，以及一种调节EnMSCs旁分泌作用的培养方法。(二)
技术介绍
如今心脑血管疾病已经成为威胁人类健康的头号杀手，尽管近年来对于治疗心血管疾病的药物治疗和介入治疗得到了迅猛发展，缺血性心肌病患者的预后有了明显的改善，但药物治疗和介入治疗的一大缺陷是无法修复坏死的心肌组织。而目前已经有大量基础研究和临床实验的成果证实骨髓间充质干细胞(Bonemarrowderivedmesenchymalstemcells，BMMSCs)对于治疗心血管疾病具有很好的效果，特别是其旁分泌效应能有效地发挥心肌保护作用，因此其在在心血管疾病中的应用是近年来研究的热点，成为攻克心血管疾病难题的一种非常有前景的治疗手段。但BMMSCs自身仍存在个体差异大，体外增殖较困难等不住，因此作为一种较为新颖的组织来源的间充质干细胞，子宫内膜来源的间充质干细胞(Endometriumderivedmesenchymalstemcells，EnMSCs)已经有实验成果证实其对于心肌梗死治疗方面EnMSCs具有比BMMSCs更加显著的治疗效果，其强大的治疗效果主要由于EnMSCs具有很强的旁分泌功能，EnMSCs除了能够分泌大量心脏保护的细胞因子和生长因子，还能分泌外泌体来保护心肌细胞免受缺氧所致的凋亡损伤，并且能促进心梗区的内皮细胞、血管平滑肌细胞增殖，实现血管新生作用。外泌体(exosome)是一种细胞分泌的脂质膜状结构的载体，其中含有蛋白质，mRNA和microRNA等成分，在细胞之间相互作用中发挥了至关重要的作用。而在干细胞研究中，其外泌体的成为了一大热点，而且已经有研究发现MSCs分泌的exosome对于心脏的保护作用。microRNAs(miRs)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，在细胞各种生理病理过程中发挥重要的作用。在众多miRs中，miR-21在心血管领域的研究被越来越多的科学家所关注，而且已经有研究发现其对于心肌细胞和内皮细胞具有显著的保护作用。目前已经有关于EnMSC发挥旁分泌作用改善心肌梗死的治疗效果的报道，但如何调控EnMSC旁分泌过程却一直没有明确的结论。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供miR-21在制备EnMSCs旁分泌作用调节剂中的应用，以及一种调节EnMSCs旁分泌作用的培养方法。本专利技术采用的技术方案是：miR-21在制备EnMSCs旁分泌作用调节剂中的应用。专利技术人发现，miR-21表达下调之后会减弱EnMSCs的旁分泌保护作用，旨在发现一种能调节EnMSCs旁分泌作用的方法。本专利技术还涉及一种调节EnMSCs旁分泌作用的培养方法，所述方法包括：将miR-21抑制表达(miRNA-21knockdown，miR-21-KD)的病毒和空载病毒转染EnMSCs，然后将转染成功的EnMSCs在常氧条件下，于细胞培养基中培养24小时以上。可培养48小时之后收取上清进行提取外泌体，然后将外泌体分别与心肌细胞和人类脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)进行共培养，用于观察心肌细胞的凋亡和HUVECs的管腔形成情况。所述常氧条件为在CO2体积浓度5％、O2体积浓度95％的混合气体中培养。所述细胞培养基为常规适用于EnMSCs体外培养的培养基，本专利技术中选用低糖DMEM培养基。专利技术人发现，与转染Null病毒相比，转染了miR-21-KD病毒的EnMSCs分泌的外泌体对于抑制缺氧条件下心肌细胞的凋亡的能力大大削弱，同时也减少了HUVECs管腔形成的长度，并且发现miR-21-KD的外泌体能削弱细胞内源性保护机制，通过细胞内多条信号传导通路，使得心肌细胞在缺氧条件下的的生存能力和HUVECs的血管新生能力大大降低。进一步研究发现，miR-21-KD的EnMSCs分泌的外泌体主要是通过促进PTEN的表达，从而抑制心肌细胞和HUVECs的Akt通路，对于缺氧条件下的心肌细胞，其降低了Bcl-2/Bax比值，上调了Caspase-3表达，明显增加了心肌细胞的凋亡，降低了其在缺氧条件下的存活能力；而对于HUVECs则减少VEGF的表达，抑制其血管新生作用。因此，miR-21对于外泌体参与的旁分泌作用具有显著的调控作用。具体的，所述方法如下：将miR-21-KD的病毒和Null病毒转染第6代的EnMSCs，然后置于含无血清的低糖DMEM培养基中，于37℃下、在CO2体积浓度5％、空气体积浓度95％的混合气体中，培养24小时，获得条件上清之后，分离提取外泌体，然后将其加入低糖DMEM后与缺氧条件下的心肌细胞进行共培养。为了检测其能调节心肌细胞抗凋亡能力，用TUNEL试剂盒来观察心肌细胞在缺氧条件下的凋亡情况。为了检测其能调节HUVECs的血管新生作用，用管腔形成实验来观察其管腔长度的差别。此外我们还用免疫印迹方法检测细胞内信号通路变化情况。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了miR-21在制备EnMSCs旁分泌作用调节剂中的应用，通过miR-21-KD，可有效抑制EnMSCs的外泌体对于心肌细胞的抗凋亡和HUVECs的血管新生的作用，从而证实其对于EnMSCs的调控作用。(四)附图说明图1为病毒转染以及Exosome的鉴定。A为EnMSC转染miR-21-KD以及Null之后的细胞和exosome的转染效率检验；B为经过分离提取之后在电镜下的exosome的形态。图2为exosome对心肌细胞细胞的保护作用和促进HUVECs的管腔形成的能力观察。A和B为miR-21-KD的EnMSCs来源的exosome无法有效保护缺氧条件下的心肌细胞。C和D为miR-21-KD的EnMSCs来源的exosome无法更好地促进HUVECs的管腔形成的能力。图3为miR-21-KD的EnMSCs提取源的exosome显著抑制了心肌保护相关的信号通路的活性。A为miR-21-KD的EnMSCs来源的exosome抑制了心肌细胞抗凋亡的通路。B为miR-21-KD的EnMSCs来源的exosome抑制了HUVECs促进血管新生的通路。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：1.从杭州易文赛生物技术有限公司中购买EnMSCs，以含10％(v/v)胎牛血清低糖DMEM培养基进行原代和传代细胞培养，放置于37℃、一定湿度的含5％CO2的混合气体(空气95％，v/v)中培养。在转染了miR-21-KD病毒以及其Null对照病毒后，当MSC生长至90％密度时，将其培养基更换成含2％已去除exosome的血清的培养基，继续培养48小时以后收取上清，再用exosome提取试剂盒进行抽提获取exosome。将获取的exosome在电镜下进行观测，结果详见图1。由图1可见，图1A和1B是EnMSCs在转染了miR-21-KD病毒以及其Null对照病毒后，对于EnMSCs以及其分泌的exosome进行PCR之后发现，与转染了Null对照病毒的EnMSCs相比，转染了miR-21-KD的EnMSCs其细胞本身以及分泌的exosome表达的m本文档来自技高网...
【技术保护点】
miR‑21在制备EnMSCs旁分泌作用调节剂中的应用。
【技术特征摘要】
1.miR-21在制备EnMSCs旁分泌作用调节剂中的应用。2.一种调节EnMSCs旁分泌作用的培养方法，所述方法包括：将miR-21抑制表达的病毒和空载病毒转染EnMSCs，然后将转染成功的EnMSCs在常氧条件下...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建安，胡新央，王侃，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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