病毒载体生产系统技术方案

本发明专利技术涉及一种核酸序列，其包含与目的核苷酸有效连接的结合位点，其中所述结合位点能够与RNA结合蛋白相互作用，从而在病毒载体生产细胞内抑制目的核苷酸的翻译。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及病毒载体的生产。更具体而言，本专利技术涉及在病毒载体生产细胞中改变由病毒载体编码的目的核苷酸的翻译。
技术介绍
基因治疗广泛涉及使用遗传物质来治疗疾病。它包括在具有缺陷基因(例如，包含突变的那些)的细胞内利用这些基因的功能性拷贝进行补充、使不正常工作的基因失活以及引入新的治疗基因。治疗性遗传物质可利用载体引入到宿主靶细胞中，从而使得能够传递核酸。这样的载体一般可以分为病毒类和非病毒类。作为病毒复制循环的一部分，病毒自发地将它们的遗传物质引入到宿主靶细胞中。经工程改造的病毒载体利用这种能力，从而能够向靶细胞递送目的核苷酸(NOI)。迄今为止，许多病毒已被工程改造为用于基因治疗的载体。这些病毒包括逆转录病毒、腺病毒(ADV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)和牛痘病毒。除了改造为携带目的核苷酸，病毒载体通常还经工程改造为复制缺陷型。这样，重组载体可直接感染靶细胞，但不能产生下一代感染性病毒粒子。其他类型的病毒载体可以为仅在癌细胞内具有条件复制能力，并且还可以编码有毒转基因或酶原。逆转录病毒载体已经被开发为用于治疗各种遗传紊乱，并且目前已经表明其在临床试验中具有与日俱增的前景(例如，文献“Galy,A.and A.J.Thrasher(2010)Curr Opin Allergy Clin Immunol 11(6):545-550”；“Porter,D.L.,B.L.Levine,M.Kalos,A.Baggand C.H.June(2011)N Engl J Med 365(8):725-733”；“Campochiaro,P.A.(2012)Gene Ther 19(2):121-126”；“Cartier,N.,S.Hacein-Bey-Abina,C.C.Bartholomae,P.Bougneres,M.Schmidt,C.V.Kalle,A.Fischer,M.Cavazzana-Calvo and P.Aubourg(2012)Methods Enzymol 507:187-198”；“Sadelain,M.,I.Riviere,X.Wang,F.Boulad,S.Prockop,P.Giardina,A.Maggio,R.Galanello,F.Locatelliand E.Yannaki(2010)Ann N Y Acad Sci 1202:52-58”；“DiGiusto,D.L.,A.Krishnan,L.Li,H.Li,S.Li,A.Rao,S.Mi,P.Yam,S.Stinson,M.Kalos,J.Alvarnas,S.F.Lacey,J.K.Yee,M.Li,L.Couture,D.Hsu,S.J.Forman,J.J.Rossi and J.A.Zaia(2010)Sci Transl Med 2(36):36ra43and Segura MM,M.M.,Gaillet B,Garnier A.(2013)Expert opinion in biological therapy”)。这种载体的重要实例包括γ逆转录病毒载体系统(基于MMLV)、灵长类动物慢病毒载体系统(基于HIV-1)和非灵长类动物慢病毒载体系统(基于EIAV)。反向遗传学已经使这些基于病毒的载体被大量工程改造，从而可以通过利用适当的DNA序列转染哺乳动物细胞来产生编码大的异源序列(大约10kb)的载体(参见综述“Bannert,K.(2010)Caister AcademicPress:347-370”)。在研究阶段，逆转录病毒载体的工程改造和使用通常涉及生产报告基因载体，其编码(例如)GFP或lacZ。这些临床上不相关的载体的滴度通常在1×106至1×107转导单位每毫升(TU/mL)粗收集物的范围内。这种收集物的进一步浓缩和纯化可以获得超过1×1010TU/mL的工作储存液。然而，与这些报告载体相比，生产编码治疗相关NOI的载体经常导致滴度大幅下降。以下几个因素是这种作用的潜在原因：1.治疗性基因组的尺寸。非常大的基因组可以被逆转录病毒包装，但是认为随着尺寸增加，逆转录和/或整合步骤效率降低。2.载体基因组RNA的稳定性。该稳定性可能由于NOI内存在不可预测的不稳定因素而降低。3.在载体基因组RNA内使用次优核苷酸。野生型病毒基因组通常有一定的核苷酸偏好(例如，HIV-1富含AT)。载体基因组往往不太富含AT，这可能会影响包装和/或后成熟步骤。4.在病毒载体生产细胞内的NOI的表达。(过)表达蛋白可能间接或直接影响载体病毒粒子组装和/或感染性。我们已经凭经验证明了在病毒载体生产细胞内表达由NOI编码的蛋白质可以对治疗性载体滴度产生不利影响(参见图3i和3ii)。将由目的核苷酸编码的蛋白(目的蛋白，POI)引入到载体病毒粒子中也可能会影响载体颗粒的下游加工；例如，编码跨膜POI的目的核苷酸可能会导致在病毒载体病毒粒子内跨膜蛋白的高表面表达，从而潜在地改变该病毒粒子的物理性质。此外，该引入可以在递送位点将POI呈递给患者的免疫系统，这可能在体内对治疗性基因的转导和/或长期表达产生负面影响。目的核苷酸还可以诱导产生不希望的、会影响生产、纯化、回收和免疫原性的二级蛋白或代谢物，因此希望将这些不利影响降至最低程度。对于在病毒载体生产细胞内抑制目的核苷酸的表达，同时在靶细胞中保持目的核苷酸有效表达的能力存在明确的需求。无论采用任何机制，病毒载体颗粒组装的“自然”途径和所得功能必须不能受到阻碍。然而，这并不简单，因为将被包装到病毒粒子中的病毒载体基因组分子必然会编码目的核苷酸表达盒。换句话说，由于载体基因组分子和目的核苷酸表达盒有效连接，所述目的核苷酸表达盒的改变可能对在细胞内产生载体基因组分子的能力造成不良后果。例如，如果将物理转录阻碍(例如TetR阻遏系统)用于抑制目的核苷酸表达盒，则可能的情况是载体基因组分子的产生通过空间位阻也会被抑制。此外，在病毒粒子成熟和释放后，控制机制的改变还必须不对载体基因组分子的功能产生不利影响(即，关于指导对靶细胞的转导)。例如，逆转录病毒载体的基因组RNA分子必须能够进行逆转录和整合过程——对于目的核苷酸表达盒的任何改变必须不得妨碍转导过程中的这些步骤。抑制病毒载体生产细胞内的目的核苷酸表达可能会具有进一步的优点。如果目的核苷酸的表达导致载体生产细胞的活力降低，则对其的抑制可有益于需要大量细胞数的大规模生产。在粗载体收集物内，由于细胞死亡导致的细胞碎片的减少也会使杂质降低。载体平台(即在相同的载体系统中编码不同的治疗性基因)的加工、纯化和浓缩可被标准化；如果在载体生产过程中，需要病毒载体生产细胞中仅表达异源基因，则对于治疗性载体的整个平台而言，更易于优化下游加工，从而导致载体制剂具有非常相似的物理参数。可以将获得的载体的体内免疫应答变化性和毒性降至最低，这可导致治疗性目的核苷酸在靶细胞内更持久的表达。将目的核苷酸的表达限制在生产细胞中的组织特异性启动子是一种可能解决这个问题的方案，尽管这些启动子的渗漏可能导致转基因蛋白的不利水平。然而，可使用组成型启动子来实现目的核苷酸在靶细胞内更多、更强的表达。的确，这样的强表达可能是体内的有效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸序列，其包含与目的核苷酸有效连接的结合位点，其中所述结合位点能够与RNA结合蛋白相互作用，从而在病毒载体生产细胞内抑制目的核苷酸的翻译。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.20 GB 1322798.81.一种核酸序列，其包含与目的核苷酸有效连接的结合位点，其中所述结合位点能够与RNA结合蛋白相互作用，从而在病毒载体生产细胞内抑制目的核苷酸的翻译。2.根据权利要求1所述的核酸序列，其中所述RNA结合蛋白为色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)。3.根据权利要求1或2所述的核酸序列，其中所述目的核苷酸在缺乏RNA结合蛋白的靶细胞中进行翻译。4.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点包含多个RAGN2-3重复序列。5.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点包含多个RAGN2重复序列。6.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点至少包含6个RAGN2重复序列。7.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点至少包含8个RAGN2-3重复序列。8.根据权利要求7所述的核酸序列，其中RAGNNN重复的数目为1以下。9.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点包含8-11个RAGN2重复序列。10.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点包含11个RAGN2-3重复序列，其中RAGNNN重复的数目为3以下。11.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述目的核苷酸产生治疗效果。12.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述核酸序列进一步包含RRE序列或其功能性替代物。13.一种病毒载体，包含根据前述任一项权利要求所述的核酸序列。14.根据权利要求13所述的病毒载体，其包含多于一个目的核苷酸，并且其中至少一个目的核苷酸有效连接至权利要求1至12中任一项所限定的结合位点。15.根据权利要求13或14所述的病毒载体，其衍生自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒或杆状病毒。16.根据权利要求15所述的病毒载体，其衍生自慢病毒.17.根据权利要求16所述的慢病毒载体，其衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒。18.一种病毒载体生产系统，其包含一组编码生产病毒载体所需元件的核酸序列，其中载体基因组包含根据权利要求1至12中任一项所述的核酸序列。19.根据权利要求18所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体衍生自逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。20.根据权利要求19所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体，并且所述病毒载体生产系统进一步包含编码Gag和Pol蛋白、RNA结合蛋白、和Env蛋白的核酸序列，或其功能性替代物。21.根据权利要求20所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体生产系统进一步包含编码rev的核酸序列或其功能性替代物。22.根据权利要求19至21中任一项所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体衍生自慢病毒。23.根据权利要求22所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒。24.根据权利要求18至23中任一项所述的病毒载体生产系统，其中所述RNA结合蛋白为色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)。25.一种DNA构建体，其用于根据权利要求18至24中任一项所述的病毒载体生产系统，所述DNA构建体包含根据权利要求1至12中任一项所述的核酸序列。26.一种DNA构建体，其用于根据权利要求18至24中任一项所述的病毒载体生产系统，所述DNA构建体包含编码RNA结合蛋白的核酸序列。27.根据权利要求26所述的DNA构建体，其中所述构建体包含编码色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)的核酸序列。28.一组DNA构建体，其用于根据权利要求18至24中任一项所述的病毒载体生产系统，所述一组DNA构建体包含根据权利要求25所述的DNA构建体、编码Gag和Pol蛋白的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔·法尔利，基里亚科斯·米特罗帕努斯，
申请(专利权)人：牛津生物医学英国有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB