聚合物/核酸复合物的溶液的制备制造技术

本发明专利技术涉及聚合物/核酸复合物的溶液的制备，以及这样的溶液在用于细胞转染的方法中的用途。用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】聚合物/核酸复合物的溶液的制备


[0001]本专利技术涉及聚合物/核酸复合物的溶液的制备，以及这样的溶液在用于细胞转染的方法中的用途。

技术介绍

[0002]转染是故意将核酸引入真核细胞的工艺。在许多情况下，将各种类型的外源核酸引入真核细胞可能是希望的或有利的。常用的外源核酸有质粒DNA、RNA、siRNA和寡核苷酸。一旦递送到细胞中，核酸就会通过驱动目的基因的过表达或沉默来调节基因表达。
[0003]基因过表达是几种应用不可或缺的工具，这些应用从了解目的基因的作用(基因研究、高通量筛选)到生物制剂(如抗体(蛋白质生产)和重组病毒颗粒)的生产，特别是用于治疗目的(病毒生产，例如用于基因和细胞治疗)。
[0004]基因沉默是用于阻止目的基因表达的方法。可以部分减少(基因敲低)或完全阻断(基因敲除)基因表达。因为任何基因都可能成为靶标，因此基因沉默是一种普遍的技术，用来开发基于基因的疗法，以解决单基因病理、癌症和免疫治疗策略。可以看出，转染在许多不同的应用中有很多用途。特别感兴趣的是用表达载体转染细胞，这广泛用于生物药剂(包括重组蛋白质和病毒载体)的生产中。例如，制造病毒载体的常用方法包括用载体DNA组分转染原代细胞或哺乳动物/昆虫细胞系，随后是有限的孵育期，以及然后从培养基和/或细胞中收获粗载体(Merten,O
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W.等人,2014,Pharmaceutical Bioprocessing[药物生物工艺],2:183
‑
203)。制造慢病毒载体的效率典型地受
>‘
上游阶段
’
几个因素的影响，包括[1]使用的病毒血清型/假型、[2]转基因序列组成和大小、[3]培养基组成/充气/pH、[4]转染试剂/工艺、[5]化学诱导和载体收获时间、[6]细胞脆性/活力、[7]生物反应器剪切力和[8]杂质。显然，
‘
下游
’
纯化/浓缩阶段期间需要考虑其他因素(Merten,O
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W.等人,2014,Pharmaceutical Bioprocessing[药物生物工艺],2:237
‑
251)。
[0005]随着病毒载体方法在临床试验中的成功开始走向监管批准和商业化，关注点集中在良好操作规范(GMP)级载体材料的大规模生产中新出现的瓶颈(Van der Loo JCM,Wright JF.,2016,Human Molecular Genetics[人类分子遗传学],25(R1):R42
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R52)。GMP级重组蛋白质的生产中也存在类似的瓶颈。
[0006]克服这一挑战的一种方法是找到在病毒载体或重组蛋白质的生产过程中最大限度地提高转染效率的新方法。因此，本领域需要提供用于在生产例如病毒载体和其他生物药剂中使用的替代和改进的转染方法，这有助于解决与GMP级材料(如GMP级载体材料)的大规模生产相关的已知问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术诸位专利技术人已证实，在对转染效率产生负面影响之前，聚合物/核酸复合物在存在盐的情况下仅在短时间内稳定。这限制了阳离子聚合物在生物药剂的大规模生产中的使用，因为最佳孵育期太短以致于实际上在大规模GMP生产中是不可能的。
[0008]本专利技术提供了改进的细胞转染方法。在此方面，本专利技术诸位专利技术人出人意料地发现，通过在基本上无盐水溶液(例如水)中混合核酸和阳离子聚合物来制备聚合物/核酸复合物，随后添加盐以诱导聚合物/核酸复合物成熟，延长了最佳聚合物/核酸复合物成熟的时间并提供了高转染效率。因此，最佳浓度的盐可用于延长最佳聚合物/核酸复合物成熟的时间(即孵育时间)。本专利技术诸位专利技术人进一步出人意料地发现，通过稀释聚合物/核酸复合物的溶液(从而稀释盐)，可以缩减聚合物/核酸复合物的生长并稳定复合物，以进一步延长孵育时间。因此，本文所述的方法是有利的，因为它提供了控制聚合物/核酸复合物成熟的开始和/或终止的能力。这反过来又非常有利于GMP级材料的大规模生产，因为它消除了转染工艺的时间限制问题，即提高了制造工艺的灵活性。
[0009]本专利技术诸位专利技术人出人意料地发现，控制聚合物/核酸复合物成熟的开始和/或终止的能力与降低细胞毒性结合是有利的，因为它提供了在转染期间根据细胞数量调整聚合物/核酸复合物的制备的能力。这反过来又非常有利于GMP级材料的大规模生产，因为它能够在转染工艺中使用更高的细胞密度(例如使用灌注培养实现的细胞密度)，即提高制造工艺的能力和产量。
[0010]本专利技术涉及这样的用于制备聚合物/核酸复合物的溶液的方法以及该溶液用于细胞转染，例如在慢病毒载体生产中的用途。
[0011]在一方面，本专利技术提供了用于产生聚合物/核酸复合物的溶液的体外方法，该方法包括以下步骤：
[0012]a)在基本上无盐的水溶液中混合核酸和阳离子聚合物；
[0013]b)将盐添加至步骤a)中产生的混合物中，以形成盐溶液；
[0014]c)任选地孵育步骤b)中产生的盐溶液；和/或
[0015]d)任选地稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液，
[0016]其中所述盐不是丙戊酸盐、异丁酸盐或异戊酸盐。
[0017]在另一方面，本专利技术提供了用于产生聚合物/核酸复合物的溶液的体外方法，该方法包括以下步骤：
[0018]a)在基本上无盐的水溶液中混合核酸和阳离子聚合物；
[0019]b)将盐添加至步骤a)中产生的混合物中，以形成盐溶液；
[0020]c)任选地孵育步骤b)中产生的盐溶液；和/或
[0021]d)任选地稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液，
[0022]其中仅在该聚合物/核酸复合物的溶液与细胞接触前添加所述盐。
[0023]在另一方面，本专利技术提供了用于产生聚合物/核酸复合物的溶液的体外方法，该方法包括以下步骤：
[0024]a)在基本上无盐的水溶液中混合核酸和阳离子聚合物；
[0025]b)将盐添加至步骤a)中产生的混合物中，以形成盐溶液；
[0026]c)任选地孵育步骤b)中产生的盐溶液；和/或
[0027]d)任选地稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液，
[0028]其中步骤b)中的最终盐浓度在约10mM至约100mM之间。
[0029]在另一方面，本专利技术提供了用于产生聚合物/核酸复合物的溶液的体外方法，该方法包括以下步骤：
[0030]a)在基本上无盐的水溶液中混合核酸和阳离子聚合物；
[0031]b)将盐添加至步骤a)中产生的混合物中，以形成盐溶液；
[0032]c)任选地孵育步骤b)中产生的盐溶液；和/或
[0033]d)任选地稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液，
[0034]其中所述盐在该基本上无盐水溶液中具有至少0.95的解离度。
[0035]在另一方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于产生聚合物/核酸复合物的溶液的体外方法，该方法包括以下步骤：a)在基本上无盐的水溶液中混合核酸和阳离子聚合物；b)将盐添加至步骤a)中产生的混合物中，以形成盐溶液；c)任选地孵育步骤b)中产生的盐溶液；和/或d)任选地稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液，其中所述盐不是丙戊酸盐、异丁酸盐或异戊酸盐。2.一种用于产生聚合物/核酸复合物的溶液的体外方法，该方法包括以下步骤：a)在基本上无盐的水溶液中混合核酸和阳离子聚合物；b)将盐添加至步骤a)中产生的混合物中，以形成盐溶液；c)任选地孵育步骤b)中产生的盐溶液；和/或d)任选地稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液，其中仅在该聚合物/核酸复合物的溶液与细胞接触前添加所述盐。3.一种用于产生聚合物/核酸复合物的溶液的体外方法，该方法包括以下步骤：a)在基本上无盐的水溶液中混合核酸和阳离子聚合物；b)将盐添加至步骤a)中产生的混合物中，以形成盐溶液；c)任选地孵育步骤b)中产生的盐溶液；和/或d)任选地稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液，其中步骤b)中的最终盐浓度在约10mM至约100mM之间。4.一种用于产生聚合物/核酸复合物的溶液的体外方法，该方法包括以下步骤：a)在基本上无盐的水溶液中混合核酸和阳离子聚合物；b)将盐添加至步骤a)中产生的混合物中，以形成盐溶液；c)任选地孵育步骤b)中产生的盐溶液；和/或d)任选地稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液，其中所述盐在该基本上无盐水溶液中具有至少0.95的解离度。5.一种用于产生聚合物/核酸复合物的溶液的体外方法，该方法包括以下步骤：a)在基本上无盐的水溶液中混合核酸和阳离子聚合物；b)将盐添加至步骤a)中产生的混合物中，以形成盐溶液；c)任选地孵育步骤b)中产生的盐溶液；和/或d)稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液。6.一种用于产生聚合物/核酸复合物的溶液的体外方法，该方法包括以下步骤：a)在基本上无盐的水溶液中混合核酸和阳离子聚合物；b)将盐添加至步骤a)中产生的混合物中，以形成盐溶液；c)孵育步骤b)中产生的盐溶液；和/或d)任选地稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该核酸选自DNA、RNA、寡核苷酸分子及其混合物。8.根据权利要求7所述的方法，其中该核酸是DNA，优选地质粒DNA。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该阳离子聚合物是基于聚合物的转染试剂。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺(PEI)、树枝状聚合物、DEAE
‑
葡聚糖、聚丙烯亚胺(PPI)、壳聚糖[聚
‑
(β
‑
1/4)
‑2‑
氨基
‑2‑
脱氧
‑
D
‑
吡喃葡萄糖]、聚
‑
L
‑
赖氨酸(PLL)、聚(乳酸
‑
乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚(己内酯)(PCL)及其衍生物。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该阳离子聚合物是PEI或其衍生物，优选地选自线性PEI、支链PEI、聚乙二醇化PEI、JetPEI、PEI MAX和PTG1+。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该盐选自钠盐、镁盐、钾盐、钙盐、磷酸盐及其混合物。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该盐是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。14.根据权利要求1、2和4至13中任一项所述的方法，其中该盐是PBS，并且在步骤b)中，添加PBS至最终浓度在约0.1X PBS至约1.0X PBS之间，优选地其中添加PBS至最终浓度在约0.1X PBS至约0.3X PBS之间。15.根据权利要求1、2和4至14中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，添加该盐至最终浓度在约10mM至约100mM之间，优选地其中在步骤b)中，添加该盐至最终浓度在约20mM至约100mM之间。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤a)包括在基本上无盐水溶液中混合多种核酸分子和多种阳离子聚合物分子。17.根据权利要求1至5和7至17中任一项所述的方法，其中该方法包括孵育步骤b)中产生的盐溶液的步骤。18.根据权利要求6或权利要求17所述的方法，其中将该盐溶液孵育约1分钟至长达约2小时，优选地其中将该盐溶液孵育约20分钟至约90分钟。19.根据权利要求18所述的方法，其中将该盐溶液孵育约60分钟。20.根据权利要求1至4和6至17中任一项所述的方法，其中该方法包括稀释步骤b)中产生的盐溶液或稀释步骤c)的孵育后的盐溶液的步骤。21.根据权利要求5或权利要求20所述的方法，其中该盐是PBS，并且将该盐溶液稀释至最终浓度在约0.05X PBS至约0.15X PBS之间，优选地其中将该盐溶液稀释至最终浓度为约0.1X PBS。22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该核酸编码逆转录病毒载体组分。23.根据权利要求22所述的方法，其中该逆转录病毒载体是复制缺陷型逆转录病毒载体。24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，其中该逆转录病毒载体是慢病毒载体，优选地其中该慢病毒载体是HIV
‑
1、HIV
‑
2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳病毒。25.根据权利要求24所述的方法，其中该载体组分选自：a)该慢病毒载体的RNA基因组；b)env或其功能替代物；c)gag
‑
pol或其功能替代物；和/或d)rev或其功能替代物。26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括以下步骤：e)任选地在灌注培养中培养哺乳动物细胞；
f)使用通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的聚合物/核酸复合物的溶液转染哺乳动物细胞；g)任选地将与该聚合物/核酸复合物的溶液的核酸不同的核酸引入该哺乳动物细胞；h)任选地选择哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞具有整合到其基因组内的一种或多种核酸；i)任选地在表达该一种或多种核酸的条件下培养该哺乳动物细胞；j)任选地在产生该逆转录病毒载体的条件下培养该哺乳动物细胞；以及k)任选地分离该逆转录病毒载体。27.根据权利要求26所述的方法，其中该方法包括在灌注培养中培养哺乳动物细胞的步骤。28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中该在灌注培养中培养哺乳动物细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：O，
申请(专利权)人：牛津生物医学英国有限公司，
类型：发明
国别省市：