细菌T6SS核心组分VgrG作为药物递送载体的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种细菌T6SS核心组分VgrG作为药物递送载体的构建方法，属于生物技术领域。本发明专利技术通过实验证明，蛋白质类药物与VgrG的融合蛋白可以在细菌内表达和合成，并通过搭载上述T6SS核心组分被分泌到胞外。该药物分泌体系在向真核细胞和生物体内输送大分子药物方面具有重要的应用潜力。方面具有重要的应用潜力。方面具有重要的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
细菌T6SS核心组分VgrG作为药物递送载体的构建方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种细菌VI型分泌系统(T6SS)核心组分VgrG作为药物递送载体的构建方法；尤其涉及一种T6SS核心组分VgrG分泌蛋白质类药物的体系的构建方法。

技术介绍

[0002]近年来，制药行业趋向于复杂的大分子疗法，大分子药物包括基于蛋白质的疗法，如抗体、激素、生长因子和细胞因子，以及基于核酸的疗法，如短干涉RNA、DNA/RNA疫苗和基因疗法。大分子药物的分子大小和复杂性使其具有高度的特异性，因此与小分子药物相比，大分子药物具有更强的效力和更少的副作用。尽管如此，大分子药物仍然面临着小分子药物所没有的几个重大挑战，其中需要解决的关键问题之一就是药物的高效递送策略。
[0003]大分子药物往往极易在胃和肠道中降解，导致这些药物的剂型受到了限制，通常只能作为注射剂来使用，方便程度远低于口服；此外分子量太大和亲水性极大地限制了其对生物膜的渗透，从而导致生物利用度低。
[0004]细菌作为单细胞、结构简单的原核生物，种类和代谢类型多种多样，其生长速度快，便于大规模培养，其基因表达的调控机制研究的较为透彻，易于进行遗传操作，获得各类突变株。利用细菌作为药物的递送载体，则可以解决大分子药物在工业生产中的提纯和药物稳定性方面的困难，还可以按需对目的蛋白进行改造和修饰，从而改进药物的作用效果。其次，随着对细菌与自然宿主对抗机制了解的深入，研究者已发现多种细菌具有的独特的分泌系统，可以将目的蛋白直接递送到靶细胞的细胞质中，VI型分泌系统(T6SS)便是其中之一。T6SS是由13个组件组装成的一个大型复合体，主要位于细菌的细胞质内，其核心分泌装置包括Hcp六聚体组成的分泌内管，由TssB和TssC蛋白(也称为VipA和VipB)组成的收缩鞘以及VgrG和PAAR在Hcp管的顶端形成一个“尖刺”。鞘收缩时，Hcp管和尖端蛋白会刺穿细胞膜，被注射到靶细胞中。目前，已有研究将内酰胺酶与T6SS融合并成功用于真核细胞的传递试验。此外，还有研究利用霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的T6SS成功地将Cre重组酶传递给受体细菌对其进行基因编辑，而不需要将外源DNA引入受体细菌，该系统还能够将外源抗菌毒素TseC注射到相邻的绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中将其杀死。但目前并没有利用T6SS递送已上市或在研的多肽和蛋白质类药物的相关报道。

技术实现思路

[0005]基于以上技术问题，本专利技术的目的在于一种细菌T6SS核心组分VgrG作为药物递送载体的构建方法。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种VI型分泌系统T6SS核心组分VgrG作为蛋白质类药物载体的构建方法，所述构建方法包括：在霍乱弧菌V52菌株中，转入将VgrG自身所连接的效应蛋白序列替换为目的药物序列的质粒，即获得分泌蛋白质类药物的体系。
[0008]作为本专利技术的一个实施方案，所述霍乱弧菌V52菌株是以霍乱弧菌RHH V52为原始菌株，失活突变了数个T6SS毒性蛋白的突变菌株。所述数个T6SS毒性蛋白包括TseL,VasX,TseH和VgrG1。在一个具体实施示例中，所述霍乱弧菌V52菌株是以霍乱弧菌V52“RHH”(ΔhlyA(VCA0219)，ΔhapA(VCA0865)，ΔrtxA(VC1451))为原始菌株，将效应蛋白TseL(VC1418)第425位的天冬氨酸突变为丙氨酸，并将效应蛋白TseH(VCA0285)第64位的组氨酸突变为丙氨酸，且敲除了效应蛋白VasX(VCA0020)第852
‑
867位的16个氨基酸，敲除VgrG1(VC1416)的C端肌动蛋白交联结构域(C
‑
terminal actin crosslinking domain，ACD)第716
‑
1149位共434个氨基酸得到的菌株作为背景菌株。
[0009]作为本专利技术的一个实施方案，以pBAD33质粒骨架作为载体，将VgrG所连接的效应蛋白序列替换为目的蛋白序列；质粒通过电转导入霍乱弧菌V52背景菌株中，通过PCR鉴定，挑选出导入了正确质粒的菌株。
[0010]所述构建方法包括如下步骤：
[0011]S1、以质粒pBAD33
‑
VgrG3(1
‑
645aa)
‑
Cre
‑
3V5为模板进行PCR扩增，获得载体pBAD33
‑
VgrG3(1
‑
645aa)
‑
3V5；
[0012]S2、将目的蛋白片段克隆到载体pBAD33
‑
VgrG3(1
‑
645aa)
‑
3V5中，得到pBAD33
‑
VgrG3(1
‑
645aa)
‑
X
‑
3V5质粒，其中X指代目的药物序列；
[0013]S3、pBAD33
‑
VgrG3(1
‑
645aa)
‑
X
‑
3V5质粒转入所述霍乱弧菌V52菌株，得到VgrG
‑
X融合蛋白表达菌株。
[0014]作为本专利技术的一个实施方案，步骤S1中，扩增采用的引物为pBAD33
‑
VgrG3
‑
linker
‑
R和pBAD33
‑
VgrG3
‑
V5
‑
F。
[0015]作为本专利技术的一个实施方案，步骤S2中，扩增目的片段采用的引物为VgrG3
‑
X
‑
F和X
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V5
‑
R。
[0016]作为本专利技术的一个实施方案，所述目的药物为DNA长度大于100bp的药物。包括Lixisenatide、Lunasin、Lepirudin、Ecallantide、Mecasermin、Glatiramer、Proinsulin、Becaplermin、PDCD5、Sargramostim、Aldesleukin、Metreleptin、Anakinra、Tasonermin、Filgrastim、Oprelvekin、Somatotropin、Dulaglutide、Rasburicase、Parkin、Denileukin diftitox、Tenecteplase和Albiglutide。
[0017]第二方面，本专利技术提供一种所述构建方法构建得到的VgrG携带药物的分泌体系。
[0018]作为本专利技术的一个实施方案，目的药物与VgrG的融合蛋白能够在菌体内表达和合成。
[0019]作为本专利技术的一个实施方案，目的药物通过搭载VgrG，被分泌到细菌胞外。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以VI型分泌系统T6SS核心组分VgrG作为多肽和蛋白质类药物载体的分泌体系的构建方法，其特征在于，在霍乱弧菌V52菌株中，转入将VgrG自身所连接的效应蛋白序列替换为目的药物序列的质粒，即获得分泌多肽和蛋白质类药物的体系。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述霍乱弧菌V52菌株是以霍乱弧菌RHH V52为原始菌株，失活突变了T6SS毒性蛋白TseL,VasX,TseH和VgrG1的突变菌株。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：S1、以质粒pBAD33
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VgrG3(1
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645aa)
‑
Cre
‑
3V5为模板进行PCR扩增，获得载体pBAD33
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VgrG3(1
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645aa)
‑
3V5；S2、将目的蛋白片段克隆到载体pBAD33
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VgrG3(1
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645aa)
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3V5中，得到pBAD33
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VgrG3(1
‑
645aa)
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X
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3V5质粒，其中X指代目的药物序列；S3、pBAD33
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Vg...

【专利技术属性】
技术研发人员：董涛，涂琬之，李浩，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：