病毒载体生产制造技术

本发明专利技术提供了用于产生病毒载体的新方法。还提供了相应的病毒载体生产系统和用途。还提供了相应的病毒载体生产系统和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】病毒载体生产


[0001]本专利技术提供了用于产生病毒载体的新方法。还提供了相应的病毒载体生产系统和用途。

技术介绍

[0002]在过去几十年里，在科学期刊和专利中很好地记录了针对疫苗和人基因疗法的病毒载体的开发和生产。工程化病毒用于治疗作用递送转基因的用途是广泛的。基于RNA病毒，如γ
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逆转录病毒和慢病毒(Muhlebach,M.D.等人,2010,Retroviruses:Molecular Biology,Genomics and Pathogenesis,13:347
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370；Antoniou,M.N.,Skipper,K.A.&Anakok,O.,2013,Hum.Gene Ther.,24:363
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374)和DNA病毒，如腺病毒(Capasso,C.等人2014,Viruses,6:832
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855)和腺病毒相关病毒(AAV)(Kotterman,M.A.&Schaffer,D.V.,2014,Nat.Rev.Genet.,15:445
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451)的现代基因疗法载体已在越来越多的人类疾病适应症中显示出前景。这些包括患者细胞用于血液学病况(Morgan,R.A.&Kakarla,S.,2014,Cancer J.,20:145
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150；Touzot,F.等人2014,Expert Opin.Biol.Ther.,14:789
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798)，和眼科(Balaggan,K.S.&Ali,R.R.,2012,Gene Ther.,19:145
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153)、心血管(Katz,M.G.等人2013,Hum.Gene Ther.,24:914
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927)、神经退行性疾病(Coune,P.G.,Schneider,B.L.&Aebischer,P.,2012,Cold Spring Harb.Perspect.Med.,4:a009431)的体内治疗和肿瘤治疗(Pazarentzos,E.&Mazarakis,N.D.,2014,Adv.Exp.Med Biol.,818:255
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280)的离体修饰。由于这些方法在临床试验中的成功开始向监管批准和商业化进行，因此注意力已集中在优良制造规范(GMP)级载体材料的大规模生产中所出现的瓶颈(Van der Loo JCM,Wright JF.,2016,Human Molecular Genetics,25(R1):R42
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R52)。
[0003]克服该困难的方式在于发现新的方法以使得病毒载体生产期间滴度最大化。病毒载体生产的常规方法包括用载体DNA组分转染原代细胞或哺乳动物/昆虫细胞系，然后是有限的孵育期，接着从培养基和/或细胞收获粗载体(Merten,O
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W.,Schweizer,M.,Chahal,P.,&Kamen,A.A.,2014,Pharmaceutical Bioprocessing,2:183
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203)。在其他情况下，在不依赖于转染的方法期间使用了生产细胞系(PrCL；其中所有必需的载体组分表达盒稳定整合到生产细胞DNA中)，其在较大规模下是有利的。病毒载体生产的效率在“上游阶段”通常受以下几个因素的影响，其包括[1]所使用的病毒血清型/假型、[2]转基因序列组成和尺寸、[3]培养基组成/充气/pH、[4]转染试剂/方法、[5]化学诱导和载体收获时机、[6]细胞脆弱性/存活力、[7]生物反应器剪切力和[8]杂质。显然，在“下游”纯化/浓缩阶段仍有其他因素要考虑(Merten,O
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W.等人2014,Pharmaceutical Bioprocessing,2:237
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251)。
[0004]因此，在本领域中需要提供有助于解决已知与GMP级载体材料的大规模生产有关的问题的生产病毒载体的替代方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术人意外地显示在病毒载体生产期间，PKC激活剂单独或与HDAC抑制剂组合
使用显著提高了病毒载体滴度。因此，本专利技术涉及PKC激活剂i)自身作为病毒载体生产的诱导剂和ii)作为病毒载体生产的HDAC抑制剂诱导的增强剂的使用。
[0006]本专利技术人还已显示用PKC激活剂处理的细胞维持了高细胞存活力，这在病毒载体生产期间是有益的。
[0007]因此，提供了用于生产病毒载体的方法，方法包括在包含PKC激活剂的细胞培养基中培养包含编码病毒载体组分的核酸序列的细胞。
[0008]适当地，病毒载体可以是自失活的病毒载体。
[0009]适当地，PKC激活剂可以是prostratin或者佛波醇12
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豆蔻酸酯13
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乙酸酯，其类似物、衍生物或药物可用的盐。
[0010]适当地，
[0011]a)prostratin可以以至少约0.5μM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中prostratin可以处于约0.5至约32μM的浓度；或者
[0012]b)佛波醇12
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豆蔻酸酯13
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乙酸酯可以以至少约1nM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中佛波醇12
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豆蔻酸酯13
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乙酸酯可以处于约1至约32nM的浓度。
[0013]适当地，病毒载体可以是慢病毒载体并且修饰的U1 snRNA可以与慢病毒载体组分共表达，其中所述修饰的U1 snRNA结合至慢病毒载体基因组序列的包装区内的核苷酸序列。
[0014]适当地，病毒载体可以是慢病毒载体，并且可以在功能上消除来自慢病毒载体的主要剪接供体区的剪接活性。
[0015]适当地，病毒载体可以是慢病毒载体，其中慢病毒载体基因组已在主要剪接供体区中突变或者在主要剪接供体区和至少一个隐蔽剪接供体区中突变。
[0016]适当地，细胞培养基还可以包含HDAC抑制剂。
[0017]适当地，HDAC抑制剂可以是脂族HDAC抑制剂或者氧肟酸HDAC抑制剂。
[0018]适当地，脂族HDAC抑制剂可以是丁酸钠、丙戊酸钠或戊酸，其类似物、衍生物或药物可用的盐。
[0019]适当地，PKC激活剂可以是prostratin并且HDAC抑制剂可以是丁酸钠。
[0020]适当地，氧肟酸HDAC抑制剂可以是次苯胺基异羟肟酸，其类似物、衍生物或药物可用的盐。
[0021]适当地，
[0022]a)丁酸钠可以以至少约2.5mM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中丁酸钠可以处于约2.5至约30mM的浓度；
[0023]b)丙戊酸钠可以以至少约3mM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中丙戊酸钠可以处于约3至约30mM的浓度；
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于生产病毒载体的方法，所述方法包括在包含PKC激活剂的细胞培养基中培养包含编码病毒载体组分的核酸序列的细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒载体是自失活病毒载体。3.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述PKC激活剂是prostratin或者佛波醇12
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豆蔻酸酯13
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乙酸酯，其类似物、衍生物或药物可用的盐。4.根据权利要求3所述的方法，其中：a)prostratin以至少约0.5μM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中prostratin处于约0.5至约32μM的浓度；或者b)佛波醇12
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豆蔻酸酯13
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乙酸酯以至少约1nM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中佛波醇12
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豆蔻酸酯13
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乙酸酯处于约1至约32nM的浓度。5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体并且修饰的U1 snRNA与所述慢病毒载体组分共表达，其中所述修饰的U1 snRNA结合至所述慢病毒载体基因组序列的包装区内的核苷酸序列。6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体并且其中已在功能上消除了来自所述慢病毒载体基因组的主要剪接供体区的剪接活性。7.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体，其中所述慢病毒载体基因组已在所述主要剪接供体区中突变或者在所述主要剪接供体区和至少一个隐蔽剪接供体区中突变。8.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基还包括HDAC抑制剂。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是脂族HDAC抑制剂或者氧肟酸HDAC抑制剂。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述脂族HDAC抑制剂是丁酸钠、丙戊酸钠或戊酸，其类似物、衍生物或药物可用的盐。11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述PKC激活剂是prostratin并且所述HDAC抑制剂是丁酸钠。12.根据权利要求9所述的方法，其中所述氧肟酸HDAC抑制剂是次苯胺基异羟肟酸、其类似物、衍生物或药物可用的盐。13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中：a)丁酸钠以至少约2.5mM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中丁酸钠处于约2.5至约30mM的浓度；b)丙戊酸钠以至少约3mM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中丙戊酸钠处于约3至约30mM的浓度；c)戊酸以至少约3mM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中戊酸处于约3至约30mM的浓度；或者d)次苯胺基异羟肟酸以至少约0.5μM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中次苯胺基异羟肟酸处于约0.5至约16μM的浓度。14.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是瞬时转染的生产细胞。15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述细胞是稳定的生产细胞。16.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞是人细胞。19.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是贴壁的。20.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞或其衍生物。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述HEK293生产细胞是HEK293T细胞。22.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述细胞处于悬浮中。23.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒载体选自：逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯性疱疹病毒载体和牛痘病毒载体。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述慢病毒载体选自：HIV
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1、HIV
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2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV和绵羊髓鞘脱落病毒慢病毒载体。26.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含所关心的核苷酸(NOI)。27.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基包含至少约5升体积的培养基。28.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基是无血清的。29.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中至少一种编码病毒载体组分的核酸序列可操作性地连接至启动子，所述启动子选自：CMV启动子、RSV启动子、CAG合成启动子、CHEF1启动子、GRP78启动子、UBC启动子、HIV
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1U3启动子和FERH启动子。30.根据权利要求30所述的方法，其中所述启动子选自：CMV启动子、RSV启动子和CAG合成启动子。31.病毒载体生产系统，其包括：i)细胞，其包括编码病毒载体组分的核酸序列；和ii)细胞培养基，其包含PKC激活剂。32.根据权利要求31所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体是自失活病毒载体。33.根据权利要求31或32所述的病毒载体生产系统，其中所述PKC激活剂是prostratin或者佛波醇12
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豆蔻酸酯13
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乙酸酯，其类似物、衍生物或药物可用的盐。34.根据权利要求33所述的病毒载体生产系统，其中：a)prostratin以至少约0.5μM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中prostratin处于约0.5至约32μM的浓度；或者b)佛波醇12
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豆蔻酸酯13
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乙酸酯以至少约1nM的浓度处于细胞培养基中，可选地其中佛波醇12
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豆蔻酸酯13
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乙酸酯处...

【专利技术属性】
技术研发人员：瑞，
申请(专利权)人：牛津生物医学英国有限公司，
类型：发明
国别省市：