用于纯化包膜病毒或病毒载体的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于纯化包膜病毒的方法。本发明专利技术的方法用于在符合良好生产规范并可以获得临床级病毒的条件下大规模回收包膜病毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于纯化包膜病毒的方法。本专利技术的方法可用于在符合良好生产规范并允许获得临床级病毒的条件下大规模回收包膜病毒。
技术介绍
源自于人免疫缺陷病毒(尤其是HIV–1)的慢病毒载体是最常用于基因疗法的载体的一部分。这些载体通常具有来自于其他病毒的糖蛋白假型：长臂猿白血病病毒(GALV；(GaLV–TR糖蛋白))，水疱性口炎病毒(VSV–g)，麻疹病毒(或MV)。用于纯化具有VSV–G蛋白假型的慢病毒载体的临床批料的方法已被描述(Schweizer和Merten，2010)。然而，具有其他包膜蛋白假型、更具体来说具有源自于GaLV或MV的糖蛋白假型的病毒载体未被广泛使用，这是因为目前没有令人满意的纯化流程可用。这种类型的假型载体的纯化的主要限制性障碍涉及某些膜糖蛋白的不稳定性和脆弱性。然而，这些载体就其与具有VSV–G蛋白假型的载体相比不太宽泛的嗜性而言，是特别令人感兴趣的。例如，具有源自于GALV的糖蛋白假型的载体具有更受限制的嗜性，并且更具体来说靶向造血干细胞。因此，提供用于纯化具有GALV糖蛋白假型的载体的高效方法，代表了基因疗法领域中的重要挑战。因此，本专利技术人提出了开发一种用于纯化包膜病毒、尤其是具有包膜糖蛋白GaLV或其他包膜蛋白假型的病毒的方法，其目的是生产用于临床用途的病毒制备物。专利技术概述本专利技术源自于由本专利技术人做出的出人意料的观察，即在包膜病毒纯化期间使用的溶液的pH的影响以及某些添加剂对所述纯化的得率的正面影响。具体来说，本专利技术源自于下述观察，即当在阴离子交换层析期间使用酸性缓冲剂时，包膜蛋白的纯化获得显著的提高。因此，本专利技术的目的是一种用于纯化包膜病毒的方法，所述方法包括阴离子交换层析，在所述层析期间使用的缓冲剂具有低于6的pH。具体来说，所述pH尤其可以在5.5至6之间。根据可替选方式，在阴离子交换层析期间使用的所述缓冲剂的pH高于或等于6，并且还包含多元醇。本专利技术人能够显示，通过在用于纯化包膜病毒的方法的一个或几个步骤期间使用的一种或几种缓冲剂中添加多元醇，可以获得纯化得率的实质性提高。具体来说，在包含超滤/渗滤步骤和随后的阴离子交换层析的纯化中，当在所述层析期间使用的缓冲剂包含多元醇时，观察到纯化得率的提高。本专利技术人还提出倒转在所述纯化期间使用的阴离子交换层析步骤和超滤/渗滤步骤、尤其是切向流过滤(TFF)的次序。在阴离子交换层析之前使用超滤/渗滤、尤其是TFF，允许显著提高包膜载体的纯化得率。因此，本专利技术还涉及一种用于纯化包膜病毒的方法，所述方法依次包括超滤/渗滤步骤、尤其是TFF步骤，随后是阴离子交换层析步骤。此外，本专利技术涉及一种用于纯化包膜病毒的方法，所述方法包含超滤/渗滤步骤、尤其是TFF步骤，所述步骤使用含有多元醇的缓冲剂来进行。更具体来说，本专利技术适应于纯化具有源自于GaLV的糖蛋白假型的病毒。在本专利技术可用之前，具有这种类型的糖蛋白假型的病毒被认为是“不可纯化的”。由于GaLV假型病毒的脆弱性，对这些病毒载体进行的不同研究使用未被纯化的载体的原始制备物。出人意料的是，本专利技术人可以显示，利用本专利技术的方法获得纯化得率的显著改进。本专利技术人也可以显示，这种方法还允许具有其他包膜糖蛋白、尤其是具有VSV–G和MV糖蛋白假型的病毒的纯化得率提高。具体实施方式包膜病毒和载体的生产包膜病毒或载体的生产在本领域中是公知的。本领域技术人员可以参考该领域中的一般性知识，尤其是下述文献所代表的一般性知识：Ansorge等，2010；Schweizer和Merten 2010；Rodrigues等，2011。生产的病毒尤其是包膜病毒载体。所述病毒载体尤其是源自于反转录病毒、特别是慢病毒。生产的反转录病毒载体尤其是源自于α反转录病毒(例如ALV，表示禽白血病病毒)、β反转录病毒(例如MMTV，表示小鼠乳腺肿瘤病毒)、γ反转录病毒(例如不同类型的MLV，表示鼠白血病病毒)、δ反转录病毒(例如不同类型的HTLV，表示人嗜T-淋巴细胞病毒)、ε反转录病毒(例如WDSV，表示大眼鲈皮肤肉瘤病毒)、泡沫病毒(例如HFV，表示人泡沫病毒，和SFV，表示猴泡沫病毒)、灵长类慢病毒例如不同类型的人免疫缺陷病毒(HIV，表示人免疫缺陷病毒)、不同类型的猴免疫缺陷病毒(SIV，表示猴免疫缺陷病毒)、或非灵长类哺乳动物慢病毒例如马传染性贫血病毒(EIAV，表示马传染性贫血病毒)、猫免疫缺陷病毒(FIV，表示猫免疫缺陷病毒)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV，表示山羊关节炎-脑炎病毒)或绵羊维斯纳-梅迪病毒(VMV，表示维斯纳梅迪病毒)。根据特定实施方式，所述包膜病毒、尤其是所述反转录病毒载体、特别是慢病毒载体，是假型的，即它包含源自于与所述反转录病毒粒子所源自的病毒不同的病毒的包膜糖蛋白、修饰的包膜糖蛋白或嵌合的包膜糖蛋白。根据特定实施方式，所述反转录病毒载体具有源自于水疱性口炎病毒(VSV–G)、麻疹病毒(MV，表示麻疹病毒)或修饰的MV病毒(尤其是用抗CMHII抗体修饰的)、狒狒内源性病毒(BaEV)或长臂猿白血病病毒(GALV)的包膜糖蛋白假型，尽管本领域技术人员可以设想使用其他病毒的包膜糖蛋白(Frecha等，2008)。根据特定实施方式，所述包膜病毒、尤其是所述反转录病毒载体、更特别为慢病毒载体，具有修饰的包膜糖蛋白假型，例如GALVTR(GALV包膜糖蛋白，其中毒粒内C-端末端已被兼嗜性人白血病病毒A–MLV的包膜糖蛋白的C-端末端代替，从而允许包膜糖蛋白非常高效地并入到慢病毒粒子中)(Christodoulopoulos和Cannon 2001)。根据特定实施方式，所述包膜病毒、尤其是所述反转录病毒载体、更特别为慢病毒载体，具有嵌合的包膜糖蛋白假型，例如其中插入有编码免疫球蛋白的重链和轻链可变区的融合蛋白(scFv，表示单链可变片段)或具有重复的锚蛋白结构域的蛋白(DARPin，表示设计的锚蛋白重复序列蛋白)，以允许特异性靶向靶细胞表面处的给定受体的麻疹病毒的包膜糖蛋白(Anliker等，2010；Münch等，2011)。根据特定实施方式，所述慢病毒载体具有源自于GALV病毒、水疱性口炎病毒(例如VSV–G包膜蛋白)或麻疹病毒的包膜假型，尽管本领域技术人员可以设想使用其他的包膜蛋白。此外，所述包膜病毒可以含有引入到它的基因组中的目标转入基因。当然，所述目标转入基因取决于所述包膜病毒载体所打算的具体用途。示例性地，我们可以提到编码治疗性RNA的目标转入基因(例如编码靶RNA或DNA序列的反义互补RNA的目标转入基因)，为患有疾病的对象中缺乏或缺少的蛋白质编码的用于基因疗法的转入基因，或用于DNA疫苗接种的转入基因，即为蛋白质编码的转入基因，所述蛋白质的表达将诱导受体身体针对所述蛋白质的疫苗接种。根据特定实施方式，可用于基因疗法的包膜病毒载体被生产，然后被纯化。有利情况下，使用的生产方法与良好实验室规范相容，并为设想大规模生产包膜病毒载体、尤其是反转录病毒载体、尤其是慢病毒载体、特别是假型慢病毒载体(特别是对于反转录病毒来说具有GALV包膜蛋白假型或对于慢病毒、VSV–G或MV来说具有GALVTR假型)，提供了可能性。根据用于生产慢病毒载体的优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于纯化包膜病毒的方法，所述方法包括阴离子交换层析步骤，在所述层析期间使用的缓冲剂‑具有低于6的pH，或‑具有高于或等于6的pH，并且还包含多元醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.17 FR 13628351.一种用于纯化包膜病毒的方法，所述方法包括阴离子交换层析步骤，在所述层析期间使用的缓冲剂-具有低于6的pH，或-具有高于或等于6的pH，并且还包含多元醇。2.权利要求1的方法，所述阴离子交换层析缓冲剂具有低于6的pH并且还包含多元醇。3.权利要求1的方法，所述缓冲剂的pH在5.5至6之间，更特别地所述pH等于5.5或6。4.前述权利要求任一项的方法，在所述阴离子交换层析步骤之前具有超滤/渗滤步骤，特别是切向流过滤。5.权利要求4的方法，所述超滤/渗滤步骤包括使用一种或几种具有5.5至7.5之间的pH并任选地包含多元醇的缓冲剂。6.前述权利要求任一项的方法，其用于从生产包膜病毒的细胞的细胞培养物的培养基纯化所述包膜病毒，所述方法包括：(a)细胞培养基的澄清；(b)用于澄清过的病毒的超滤/渗滤步骤；(c)阴离子交换层析；(d)排阻层析。7.权利要求6的方法，通过在截留滤器上过滤所述培养基来进行步骤(a)，对于所述滤器来说，截留阈值在0.2至0.45μm之间。8.权利要求6或7的方法，利用切向流过滤来进行步骤(b)。9.权利要求6至8任一项的方法，步骤(d)包括使用排阻尺寸在300至1,000kDa之间的排阻树脂。10.权利要求6至9任一项的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：德里斯·布代法，奥托维海姆·莫腾，大卫·弗纳尔，
申请(专利权)人：吉尼松公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR