一种重组仙台病毒的纯化方法技术

本发明专利技术主要涉及一种仙台病毒纯化方法，适合用于重组仙台病毒载体疫苗规模化生产，其特征在于，该方法主要包括真空过滤、亲和层析、超滤、核酸酶处理和凝胶过滤层析步骤。该方法具有操作简单、质量稳定、收率高等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，涉及一种可满足重组仙台病毒载体疫苗规模化生产的仙台病毒纯化方法。
技术介绍
仙台病毒基因组是一条负链RNA，长度为15384个核苷酸，共包括6个基因。核蛋白NP(nucleoprotein)、磷酸化蛋白P(phosphoprotein)、聚合酶大亚基L(largeprotein)和RNA共同构成核蛋白复合物RNP。基质蛋白M(matrixprotein)用于病毒颗粒的组装。血凝素神经氨酸酶HN(hemagglutinin-neuraminidase)和融合蛋白F(fusionprotein)是位于病毒胞膜上的糖蛋白，主要参与病毒粒子与宿主细胞的吸附和侵入等过程。Leader(ld)和trailer(tr)分别是仙台病毒基因组中特有的前导序列和末端序列。六个基因头尾相连排列在基因组中，每一个基因作为一个表达单元(开放式阅读框)，其中又可以分为几个独立的区域，分别是基因起始区域GS(GeneStart)、不转录区域UTR(Untranslateregion)和基因结束区域GE(GeneEnd)，I(intergenicmotif)是重复的3bp片段排列在基因和基因的连接处。仙台病毒的包装过程：pSeV质粒进入细胞后，在辅助病毒vTF7-3(Fuerst,T.R.etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8122-8126,1986)T7聚合酶的作用下开始复制正链RNA，在辅助质粒pTM-N、pTM-P和pTM-L合成的N、P和L蛋白的作用下复制成负链RNA，也就是仙台病毒基因组，然后开始表达M蛋白，HN蛋白，F蛋白，并最终包装成完整的病毒颗粒，以出芽形式形成具有感染能力的仙台病毒。随着反向遗传学技术的发展，仙台病毒被开发为胞质表达传播缺陷性的病毒载体，临床前研究已证实其携带外源基因对某些疾病，如呼吸道疾病、缺血性损伤和肿瘤等具有很好的治疗作用。由于仙台病毒属于负单链RNA病毒，病毒的复制和组装等全部生活周期均在细胞质中完成，复制时也没有DNA链合成过程，而仅以其本身为模板进行正、负链RNA的合成和转录翻译，尚没有发现其具有整合进入细胞核DNA中的机制和迹象，因此使用起来有较大的安全保障，解决了长期以来基因治疗中产生的安全性问题；其次，由于该病毒外膜含有仙台病毒所特有的F蛋白，因此可以高效地将其RNP转入细胞，复制转录后产生足够的目的蛋白产物，来达到治疗的目的；另外，由于其感染效率高，使用剂量小，因此治疗过程中由病毒本身引起的副作用要比其它载体系统小得多，安全性更高；目前已经发现，仙台病毒可以感染包括肌细胞、神经细胞和上皮细胞在内的几乎所有类型的细胞，这一特点使其应用面进一步拓宽，可被广泛用于基因治疗和基因免疫等各个领域。在临床前研究中，重组仙台病毒载体在重度下肢缺血基因治疗制剂、阿尔茨海默病(早老性痴呆症)疫苗和艾滋病疫苗中都表现出了极好的治疗效果。重组病毒在应用之前，都要在宿主细胞中增殖之后，从宿主细胞中裂解并进行纯化。选择一种合适的纯化方法对获得高纯度的重组病毒至关重要。本专利技术提供一种重组仙台病毒纯化方法，该方法可满足规模化生产重组仙台病毒载体疫苗，为大规模生产安全、有效的重组仙台病毒载体疫苗奠定了理论基础。
技术实现思路
一种重组仙台病毒的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：(1)真空过滤病毒初始液(2)亲和层析(3)超滤(4)核酸酶处理(5)凝胶过滤层析；(6)测定病毒滴度及进行SDS-PAGE电泳。其中，真空过滤病毒初始液选择0.45μm滤膜过滤。滤膜过滤后，将包含病毒的滤液进行亲和层析。亲和层析优选使用磺酸化纤维素进行。该层析介质配基为磺酸基多糖，可以和仙台病毒表面HN蛋白特异性结合，在低离子强度下可以吸附大部分仙台病毒，并可在高离子强度下将其洗脱下来，同时对病毒活性影响不大。收集的病毒培养液以低离子强度的磷酸盐缓冲液稀释后直接上亲和层析柱，低离子强度的磷酸盐缓冲液优选含75mMNaCl溶液。用低离子强度的磷酸盐缓冲液冲洗柱子后，再以高离子强度的磷酸盐缓冲液洗脱，优选为含1MNaCl的磷酸盐缓冲液，收集洗脱液。然后将病毒洗脱液进行超滤浓缩，超滤膜包优选截留分子量为500K的超滤膜包。超滤浓缩后用核酸酶处理浓缩液，以去除浓缩液中的宿主DNA杂质。本专利技术所述核酸酶是Benzonase。核酸酶处理病毒液后，继续进行凝胶过滤，凝胶过滤柱优选为Sepharose4FF层析柱，收集病毒峰即为病毒终液。病毒终液滴度测定采用血凝试验(HA)法和细胞感染单位(cellinfectiousunit，CIU)法。HA测定法：仙台病毒外膜表面存在可与红细胞表面唾液酸残基结合的HN蛋白，该蛋白同时兼具唾液酸酶活性，可裂解细胞表面糖蛋白上的唾液酸残基，但在低温下HN主要表现出的是唾液酸的结合活性，因此可以用来测定病毒的血凝滴度。在一定范围内，测定孔中细胞密度小于或等于病毒浓度时可出现完全血凝，一旦病毒数目低于细胞数目，则出现不完全血凝。因此进行滴毒测定时可以将出现完全血凝的孔定为血凝终点，此孔中的病毒粒子数与细胞数相等，由此可以计算出样品中病毒粒子的密度。如附图1所示，血球完全凝集者为阳性(全黑色圆圈)，本专利技术的纯化方法纯化的病毒终液的病毒粒子密度为：8×107×2048＝1.64x1011VP/mlCIU测定方法：纯化的病毒液为非传播型缺陷病毒，可以感染宿主细胞LLC-MK2，在其中复制并产生无感染能力的子代病毒粒子。感染后的细胞以间接免疫法染色后，通过荧光显微计数确定被检样品中有活性的病毒粒子数目。采用CIU分别测定刚从细胞中裂解得到的病毒初液和经本专利技术所述纯化方法纯化得到的病毒终液的滴度，病毒初液的滴度为2.31E+11，病毒终液的滴度为1.45E+11，用本专利技术的纯化方法的纯化效率达到62.45％。同时，本专利技术还对纯化的病毒终液进行SDS-PAGE电泳，结果可观察到仙台病毒典型的7条条带。附图说明图1显示的是本专利技术纯化得到的重组仙台病毒SDS-PAGE结果，泳道1代表分子量标准(购于Promega)，泳道2代表纯化的重组仙台病毒。图2显示的是HAU法测病毒滴度结果图，全黑圈代表血球完全凝集，圆圈中有点的代表不完全凝集或不凝集。具体实施方式实施例1真空过滤病毒初始液1.将收集的仙台病毒上清液3000ml在真空条件下进行过滤，滤膜孔径为0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组仙台病毒的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：(1)真空过滤病毒初始液；(2)亲和层析；(3)超滤；(4)核酸酶处理；(5)凝胶过滤层析；(6)测定病毒滴度及进行SDS‑PAGE电泳。

【技术特征摘要】
1.一种重组仙台病毒的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)真空过滤病毒初始液；
(2)亲和层析；
(3)超滤；
(4)核酸酶处理；
(5)凝胶过滤层析；
(6)测定病毒滴度及进行SDS-PAGE电泳。
2.权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析选用磺酸化纤维素进
行，低离子强度的磷酸盐缓冲液为75mMNaCl溶液，高离子强度的磷酸盐洗脱

【专利技术属性】
技术研发人员：张锋，唐仁陶，杨延新，于崇勋，王明晓，李银贵，
申请(专利权)人：石药集团中奇制药技术石家庄有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13