本发明专利技术涉及免疫学领域，尤其涉及一种病毒样颗粒的纯化方法。该方法将含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析。陶瓷羟基磷灰石目前尚未见用于病毒样颗粒的纯化。而本发明专利技术应用陶瓷羟基磷灰缩短了纯化步骤，成功纯化出与天然病毒具有相似形态学特征的病毒样颗粒，纯化过程收率较高，纯化产物纯度良好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学领域，尤其涉及。
技术介绍
目前常见的疫苗种类有基因工程亚单位疫苗，DNA疫苗，病毒样颗粒疫苗，减毒活 疫苗。其中，病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs)是含有某种病毒的一个或多个结 构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制。由于，VLPs和天然病毒形态相似，很大 程度上保持了蛋白的自然结构，且VLP抗原决定簇及表位与真正的病毒没有本质区别，因 此可以诱导激发较强的细胞免疫及体液免疫。并且，由于VLPs不含有病毒基因组核酸，因 此具有相对较高的安全性。目前，VLPs疫苗被认为最具有潜力的疫苗。 虽然病毒样颗粒与活病毒有相似的形态学结构，但病毒样颗粒蛋白的性质可能与 活病毒有差异，由于病毒样颗粒组装成的空间结构是什么能力使其形成正二十面体结构目 前还不是很清楚，并且其大小与杆状病毒大小相近。这就给病毒样颗粒制备过程中的纯化 带来了很多困难。 现有研究结果表明，选用常规的离子交换层析很难将目的蛋白与杂蛋白分离开 来，对VLPs的纯化通常需要经过多个步骤。然而，在纯化过程中，每增加一个步骤就会对待 纯化物造成一定的损失，步骤越多，收率越低。而病毒样颗粒的产生大多通过昆虫或酵母表 达系统获得，如纯化方式不当，则很难获得病毒样颗粒，这无疑限制了病毒样颗粒疫苗的广 泛应用。 羟基磷灰石是由钙和磷酸盐成的化合物。陶瓷羟基磷灰石（CHT)中，磷酸离子与 带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换特性，可由NaCl浓度梯度或磷酸钠浓度梯 度洗脱，其中的Ca 2+离子与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合，该结合方式对 NaCl不敏感，可由磷酸、钠浓度梯度洗脱。羟基磷灰石因陶瓷化工艺不同分为2种类型：1 型和II型。现有研究结果认为，陶瓷羟基磷灰石I型对蛋白质具有更大的保留，对酸性蛋 白质具有更大的动态载量，因此，陶瓷羟基磷灰石I型主要用于纯化大部分蛋白质（分子量 一般在IOOkd以下）；陶瓷羟基磷灰石II型由于孔径较I型大，因而对抗体和部分重组疫 苗等大分子量蛋白质的动态载量更高，而对HSA几乎无保留，因而陶瓷羟基磷灰石II型更 适合于抗体的纯化，同时II型对核酸具有更大的保留，能够分辩单、双链、超螺旋等各种高 级结构的DNA，因而也适合纯化核酸但目前普遍认为，陶瓷羟基磷灰石在纯化过程中损失量 过高，因此，尚无将陶瓷羟基磷灰石应用于病毒样颗粒的报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供。该方 法回收率高、制得的病毒样颗粒纯度大。 本专利技术提供的病毒样颗粒的纯化方法，包括以下步骤：将含有病毒样颗粒的液体 依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析。 由于陶瓷羟基磷灰石具有良好的捕捉力和选择性，能够分离其他介质不能分离的 各种比较难分离的，性质比较接近的生物分子，因此，采用CHT纯化能够大大减少纯化步 骤，且所得产物纯度较高。尽管如此，现有研究结果表明，采用陶瓷羟基磷灰石层析的方法 纯化样品损失量较高，收率较低，因此，陶瓷羟基磷灰石层析通常不适用于纯化浓度低、含 量少的物质。而病毒样颗粒通常通过真菌或昆虫细胞表达产生，其产量通常较低，因此目前 尚未有将陶瓷羟基磷灰石层析用于病毒样颗粒的纯化。本专利技术采用CHT层析，将病毒样颗 粒与CHT特异性吸附，经洗脱去除大部分大分子蛋白和杂质蛋白。在本专利技术的实施例中，陶 瓷羟基磷灰石层析的填料为CHT I型。 在本专利技术的实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl的 浓度为 〇· lmol/L ~0· 5mol/L ;pH 值为 7. 0 ~8. 5。 在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0. 2mol/L~ 0· 5mol/L，pH 值为 8. 5〇 作为优选，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0. 5mol/L 在另一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0. lmol/L~ 0· 5mol/L，pH 值为 8. 0〇 作为优选，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为0. 4mol/L。 在本专利技术的实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液为PBS缓冲液；其中NaCl的 浓度为lmol/L ;pH值为7. 0~8. 5。 在一些实施例中，陶瓷羟基磷灰石层析的洗脱液的pH值为8. 0。 PBS缓冲液，即磷酸缓冲盐溶液，其中包括NaCl、KCl、Na2HP0jP KH 2P04。本专利技术采 用的PBS缓冲液中，KCl的浓度为2. 7mmol/L，似2即04的浓度为10mmol/L，狃丨04的浓度为 2mmol/L。本专利技术实验表明，固定PBS缓冲液中KC1、Na 2HPOjP KH2PO4的浓度，而调整其中 的NaCl的浓度，以低NaCl浓度的PBS来平衡层析柱，以高NaCl浓度的PBS来洗脱病毒样 颗粒能够达到很好的纯化效果，且可以保证收率。实验表明，采用本专利技术提供给的方法，以 陶瓷羟基磷灰石层析的方法纯化病毒样颗粒的收率为86. 31%，而纯度可由60 %~70 %提 升至95%。 在本专利技术的实施例中，凝胶层析的填料为superdex-500。 在凝胶层析步骤中，收集外水体积流穿峰。经过凝胶层析后，能够去除一些小分子 蛋白。 在本专利技术的实施例中，凝胶层析平衡液为PBS缓冲液；其中NaCl的浓度为 0· 2mol/L ~0· 5mol/L ;pH 值为 7. 0 ~8. 5〇 在一些实施例中，凝胶层析的平衡液中NaCl的浓度为0· 5mol/L，pH值为8. 5。 蔗糖浓缩的主要目的是为了将目的蛋白进行富集，除去脂类和一些杂蛋白。蔗糖 的浓度和离心的速度会对浓缩结果产生影响。 在本专利技术的实施例中，蔗糖浓缩具体为：将含有病毒样颗粒的液体与含有蔗糖的 PBS缓冲液混合，27500rpm离心3~4小时；含有蔗糖的PBS缓冲液中蔗糖的质量分数为 30%〇 蔗糖浓缩采用的PBS缓冲液中，KCl的浓度为2. 7mmol/L，似2即04的浓度为 10mmol/L,腿2?0 4的浓度为 2mmol/L，NaCl 的浓度为 137mmol/L〇 经蔗糖浓缩，样品浓缩10~50倍。在一些实施例中，经蔗糖浓缩样品浓缩20倍。 本专利技术提供的纯化方法用于纯化EV71病毒样颗粒或CVA16病毒样颗粒。 作为优选，纯化EV71病毒样颗粒，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为 0· 2mol/L ~0· 5mol/L，pH 值为 8. 5〇 优选的，纯化EV71病毒样颗粒，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为 0·5mol/L〇 作为优选，纯化CVA16病毒样颗粒，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度 为 0· lmol/L ~0· 5mol/L，pH 值为 8. 5〇 优选的，纯化CVA16病毒样颗粒，陶瓷羟基磷灰石层析的平衡液中NaCl的浓度为 0·4mol/L〇 在本专利技术的实施例中，含有病毒样颗粒的液体的制备方法为：以含有CVA16或 EV71目的基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养至30%~40%的细胞出现病变；离心收获细 胞，经反复冻融后，离心去除残渣，经过滤制得含有病毒样颗粒的液体。 采用本专利技术提供的方法纯化CVA16病毒或本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，包括：将含有病毒样颗粒的液体依次经蔗糖浓缩、凝胶层析、陶瓷羟基磷灰石层析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜春来，孔维，蒋丽萍，孙世洋，
申请(专利权)人：长春百克生物科技股份公司，吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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