用于增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞制造技术

本发明专利技术涉及能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞，涉及使用动脉炎病毒感染此类细胞，涉及包括此类细胞的细胞培养物，并且涉及在此类细胞中增殖动脉炎病毒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞本专利技术涉及能够增殖动脉炎病毒(Artertivirus)的哺乳动物细胞，涉及使用动脉炎病毒感染的此类细胞，涉及包括此类细胞的细胞培养物，并且涉及用于在此类细胞中增殖动脉炎病毒的方法。动脉炎病毒家族包括马动脉炎病毒(EAV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)和猴出血热病毒(SHFV)。在这四个病毒物种中，LDV和SHFV只有较小的经济影响，因为它们分别感染小鼠和猴。与之相比，EAV，且特别是PRRSV，对社会造成了相当大的经济负担。马动脉炎病毒导致马的感染，并且因此在马养殖产业中造成复发性问题。因此其对马养殖者造成了显著的经济负担。马动脉炎病毒在所谓的“携带者公马(carrierstallion)”中产生持续的感染，其随后将病毒传播至母马，潜在地导致胎儿的流产。马养殖者小心地监控EAV的出现(特别是在公马中)，并且已经基于活减毒病毒或基于EAV结构亚单位的表达，开发出若干针对所述病毒的疫苗。然而，近期在美国新墨西哥州(2006)和法国(2007)的爆发进一步增加了兽医和马主人对EAV和EAV疫苗的兴趣。PRRSV是目前为止经济上最重要的动脉炎病毒，其影响全世界的猪养殖业。感染该病毒导致断奶猪仔至育肥猪的缓慢生长、降低的喂养效率、厌食和发热，妊娠母猪的流产和幼猪的呼吸问题。单在美国，每年与PRRSV感染有关的损失估计在约$5.60亿(2005年)和$6.64亿(2011年)。PRRSV被列为对猪产业的首位健康挑战，与其他疾病，例如，艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、猪流感、链球菌(Streptococcussp.)、轮状病毒或猪圆环病毒导致的损失时相比，其导致了最大的生产力损失。考虑到2006年PRRSV的高强毒株在东南亚的出现以及亚洲的猪产业是世界最大的事实，可以稳妥地假设世界上在该地区的损失要远远高于在美国报告的那些。尽管针对PRRSV的活减毒疫苗和灭活疫苗均可以获得，因为已证实相关疾病难以控制，PRRSV仍是猪产业的主要威胁。动脉炎病毒家族由具有大小在约13至16kb范围的基因组的正义(+)单链RNA病毒组成。感染时，RNA被翻译为两种复制酶前体多蛋白：pp1a和pp1ab。动脉炎病毒的功能非结构蛋白(nsps)来源于这些多蛋白通过其内在蛋白酶活性的切割。从多蛋白释放后，这些非结构蛋白一同形成复制和转录复合体，其负责病毒基因组的复制和编码结构蛋白的次基因组信使RNA的合成。将原型动脉炎病毒EAV的pp1a和pp1ab多蛋白通过存在于非结构蛋白1(nsp1)、nsp2和nsp4中的3个内在蛋白酶切割为至少13个非结构蛋白。动脉炎病毒nsp2在其N-端区域含有木瓜样蛋白酶(PLP)结构域。该蛋白酶通常被称为PLP2，其负责切割nsp2和nsp3之间的连接，并且其催化活性(可能因为该原因)对病毒复制是关键的。对于大多数病毒物种，情况如下：当感染时，病毒核酸的存在引发先天免疫信号级联的激活，导致转录因子诸如NF-κβ和Irf3/Irf7的激活，最终导致编码β干扰素(IFN-β)和其它促炎性细胞因子的基因转录。这个所谓的先天免疫提供了宿主针对病毒非常有用的天然防御。然而，同样的先天免疫对疫苗生产者造成了问题。全病毒疫苗的生产一般通过在体外(例如，在细胞培养物中)增殖(野生型或减毒的)病毒，随后收获子代病毒。作为先天免疫的结果，在体外生产的病毒的量通常相当低：INF-β的诱导导致了其他细胞针对病毒入侵(和随后的复制)的保护。对于数种病毒物种，该问题理论上可以通过减少生产的INF-β的量解决。然而，在动脉炎病毒的情况中，由于以下原因该方法被认为没有效果：已知动脉炎病毒非常有效地逃避了宿主的先天免疫应答。动脉炎病毒的这些强大的免疫调节能力防止了针对野生型PRRSV和针对活减毒PRRSV的有效免疫应答的诱导。因此，可以诱导的免疫水平对针对野外感染的保护是次优的。动脉炎病毒的这种免疫逃避特征的原因是已知的。其由动脉炎病毒的nsp2蛋白质导致，除了在多蛋白加工中的作用外，其还在逃避宿主先天免疫应答中具有非常强的作用。比较序列分析显示该蛋白质的PLP2域展现出与属于去泛素化酶(DUB)的含卵巢肿瘤域(OUT)类型的蛋白质的相似性(Makarova(2000))。自此已经确认动脉炎病毒PLP2确实具有真正的DUB活性并且该活性很可能被用于从先天免疫信号因子移除泛素(也进一步称为Ub)，以抑制抗病毒状态的诱导(Frias-Staheli,N.(2007),Sun,Z.(2010),vanKasteren,P.B.(2012))。除了其DUB活性，还显示动脉炎病毒PLP2将泛素样抗病毒蛋白干扰素刺激基因15(ISG15)从细胞靶蛋白移除(Frias-Staheli,N.(2007)、Sun,Z.(2012),Arguello,M.D.(2007))。该活性被称为去ISG化活性(deISGylatingactivity)。由于泛素和ISG15的密切关系，一般将PLP2域的该作用称为DUB/去ISG化活性。正是该DUB/去ISG化活性，通过抑制抗病毒状态的诱导，允许病毒绕开了宿主的第一防御。可以理解地，动脉炎病毒通过阻断INF-β诱导逃避细胞的先天免疫系统的这种特征具有在体外的结果：预期在易感染细胞(诸如通常用于增殖PRRSV的可商购获得的MA104细胞和Marc145细胞)中的体外增殖不受先天免疫系统的影响：病毒本身已经阻断了INF-β的诱导。因此，在动脉炎病毒的情况中，预期以在体外生产更多病毒为目标，减少此类细胞生产的IFN-β的量的措施，对病毒滴度没有任何影响。如上文所述，动脉炎病毒在本质上阻断宿主细胞中的体外INF-β生产，与在宿主体内生长的情况类似。然而，现在令人惊讶地发现，除了动脉炎病毒本身的阻断效果外，故意阻断细胞中的IFN-β生产，导致在这些细胞中增殖的子代动脉炎病毒量的非常显著增加。甚至常常获得高达6-7倍的病毒滴度的增加。对于上文解释的原因，考虑到已知动脉炎病毒阻断IFN-β生产，这确实是预想不到的。因此，本专利技术的第一个实施方案涉及能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞，其特征在于所述细胞缺乏其IFN-β生产。在细胞中的病毒增殖是包括病毒在细胞中复制的过程，其结果是子代病毒出现。因此能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞是能够生产所述动脉炎病毒的子代病毒的细胞。出于本专利技术的目的，根据本专利技术缺乏其INF-β生产的哺乳动物细胞是在刺激INF-β通路后，显示出INF-β增加至由该哺乳动物细胞的野生型形式在相同刺激条件下生产的INF-β的量的一半或小于一半水平的哺乳动物细胞。优选地，根据本专利技术的哺乳动物细胞显示出增加的INF-β低于相同刺激状况下的由哺乳动物细胞的野生型形式显示的INF-β的量的40%，更优选地低于30%、低于20%、低于10%或甚至低于5%(以该优选顺序)。IFN-β的水平可以通过ELISA的方式确定。在实施例部分，给出了ELISA反应的描述，其可以用于确定在刺激INF-β途径后INF-β蛋白质增加的水平。在实施例中，提供了确定和比较野生型细胞和根据本专利技术的细胞中INF-β水平的方法。按照描述，所述测试使用可商购获本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞，其特征在于所述细胞缺乏其IFN‑β生产。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.21 EP 12199169.91.能够增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞选自以下的哺乳动物细胞：MA104和Marc145细胞，其特征在于，所述细胞通过包括在合适的启动子控制下编码能够沉默IFN-β编码基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：L古伊伦，CC施里尔，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL