用带负电的颗粒对病毒制剂的色谱纯化制造技术

本发明专利技术涉及一种纯化包含期望病毒的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供填充的色谱柱，其具有带负电的多孔颗粒，(ii)将所述柱平衡到所述样品中所述期望病毒待被洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得被施加到所述填充的色谱柱的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的所述带负电的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述填充的色谱柱洗脱所述期望病毒，其中所述期望病毒处于更纯的状态且处于所述填充的色谱柱平衡到的条件。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于纯化病毒颗粒的方法。其进一步涉及这些能力与其它纯化方法的结合以达到期望的最终纯化水平。
技术介绍
具有带电荷表面的固体材料被广泛地用于病毒纯化领域中。这些材料通常包括被称为的离子交换剂，所述离子交换剂经常以两种应用形式中的任一种采用。在结合-洗脱模式中，将样品和离子交换剂平衡到允许目标病毒物质结合的条件。与带电荷表面较弱地相互作用或根本不相互作用的污染物无法结合并被消除。比病毒更强地相互作用的污染物会更强地结合。洗涤以去除未结合的污染物以后，可通过增加盐浓度来洗脱柱。这允许以结合物质与离子交换剂的相互作用强度的递增次序分级分离结合物质，由此实现高的病毒纯化程度。以流通模式，使样品和离子交换剂两者均平衡到阻止病毒结合的条件。比病毒更强烈地与离子交换剂相互作用的物质被结合且由此被去除，但比病毒更弱地结合的物质与病毒一起流通且作为污染物持续。两种模式在以多种固相结构呈现的带电荷表面上进行，所述固相结构包括填充在柱中的多孔或无孔颗粒，或直接添加到大体积水性样品中的多孔或无孔颗粒，或在整块材料(monolith)上的多孔或无孔颗粒。这些不同的体系结构赋予了不同的流动性质、能力和分辨率，但不论物理形式如何，流通或结合-洗脱色谱的限定性化学特征是恒定的。两种方法均依赖于向柱引入样品之前将离子交换剂和样品平衡到相同条件。一些色谱介质体现了电荷与其它类型的化学官能性的组合。这些介质被概括地称为混合模式或多模式材料，并且可将电荷与疏水基团、金属亲和基团或有利于氢键形成的化学基团进行不同地组合。取决于第二官能性的性质，它们在不同的化学条件下运行，但它们仍然以结合-洗脱和流通模式运行。已经描述了少数将电荷与物理官能性组合的多模式材料，例如，在带电荷材料也具有根据物质的大小来分选所述物质的能力的情况下。一个此类示例采用与正电性表面组合的可变尺寸排阻官能性。所述方法通常涉及使蛋白质以尺寸依赖性的方式进入颗粒孔中，同时表现出对蛋白质上的电荷以及缓冲液条件的协同依赖性。同用于分级分离的其它带电荷材料一样，由Hunter描述的材料被排它性地描述用于结合-洗脱和流通应用。
技术实现思路
提供了用于纯化病毒的方法、材料和试剂盒。在某些实施方案中，本专利技术提供了用于纯化含有期望病毒物质的样品的方法，所述方法包括以下步骤:(i)提供填充的色谱柱，其包含带负电的多孔颗粒，(?)将所述填充的色谱柱平衡到所述样品中期望病毒待洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得施加于所述填充的色谱柱的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的带负电的多孔颗粒的颗粒间空间，和(iv)从所述填充的色谱柱洗脱期望病毒，其中所述期望病毒处于更纯的状态且处于所述填充的色谱柱平衡到的条件。【具体实施方式】在某些实施方案中，本专利技术涉及用负电性的多孔颗粒填充的柱，其中病毒可通过静电排斥力(其不依赖于来自孔的空间位阻或与来自孔的空间位阻组合)或仅通过来自孔的空间位阻而基本上被限制于颗粒之间的空间(即颗粒间或空隙空间)。这可造成所述病毒基本上(如果不是完全地)通过空隙空间而经过柱。具体地说，空间位阻是指这样的机制:其中在阻止病毒颗粒克服由孔内的带负电的配体的构型施加的物理阻力的条件下，病毒颗粒不能进入孔空间中。许多污染性蛋白质(包括从生产病毒的宿主细胞产生的那些)和细胞培养基组分(包括盐、非离子型物质和两性离子型物质)能够进入颗粒的孔中，这被认为(不限于任何具体理论)会减慢它们穿过柱的运输，并在缓冲液流过柱时造成它们与更快迀移的病毒分离。碱性污染物可通过结合到负电性表面而进一步减慢。已经发现，该方法允许有效地分级分离尤其是病毒颗粒，不论样品条件如何，不论大多数污染物的化学特性如何，且不论在样品施加以后为了迫使抗体穿过柱而立即施加的缓冲液的组成如何。在某些实施方案中，本专利技术的一个优点是，它可在宽范围的条件(pH、盐浓度、电导率等)下实施，且因此可为了在制造和纯化期望IgG抗体或片段的过程中方便实现本专利技术的方法以及在本专利技术的方法之前或之后的方法而选择那些条件。在某些实施方案中，通过将样品施加限制为不超过柱内的带负电颗粒的颗粒间体积的体积，实现了这些独特的操作特征和结果。另外，在一些实施方案中，所述方法既不与其它类型的带负电材料(包括无孔的颗粒、膜或整块材料)一起应用，也不通过将带负电的多孔或无孔颗粒或可溶性的带负电聚合物分散在样品内来应用。相反，在本专利技术的优选实施方案中，所述方法用多孔颗粒的填充柱进行。在某些实施方案中，与使用多孔颗粒填充柱的其它病毒纯化方法相比，本专利技术是非常有利的，因为穿过颗粒间空间的运输是对流的，而不是扩散的。这允许所述方法以远高于其它颗粒-柱方法的流速有效地进行，这会转化成更高的生产力。已进一步发现，在某些实施方案中，可通过以下方式来增强本专利技术的某些实施方案的固有分级分离能力:在柱床内的颗粒上包括另外的表面官能性，只要将柱平衡到不会造成病毒被那些另外的官能性截留或显著减慢的条件。此类官能性可包括但不限于带正电的基团、疏水基团、J1-Ji键合基团、氢键合基团或金属-螯合基团。这些另外的官能性可位于与带负电的基团相同的化学部分上，位于与带负电的基团相同的多孔颗粒上，或位于可为多孔或无孔的不同颗粒上。在通过包括另外的颗粒而添加第二官能性的情况下，可施加的样品的体积限于这样的体积:其对应于将仅在柱中的带负电的多孔颗粒之间存在的颗粒间空间。该体积可被估计为柱中的带负电的多孔颗粒的重力沉降体积的约40%，但如果物理地压缩颗粒床的话，则可更小，且可通过实验定量地确定。在某些实施方案中，可通过以下方式来增强通过所述方法提供的纯化程度:用试剂预处理所述样品，以促进可能已与病毒缔合的污染物的解离。此类试剂特别包括各种解离剂，尤其包括高浓度的盐、脲、氨基酸、非离子型有机聚合物、有机溶剂和表面活性剂等。在所述方法的常规实施期间，与样品中的其它小分子一起去除解离剂。在某些实施方案中，本专利技术提供了用于纯化含有期望病毒的样品的方法，所述方法包括以下步骤:(i)提供填充的色谱柱，其包含带负电的多孔颗粒，(?)将所述柱平衡到所述样品中期望病毒待洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述柱接触，使得施加于所述柱的样品体积小于或等于所述柱内的带负电的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述柱洗脱所述期望病毒，其中所述期望病毒处于更纯的状态且处于所述柱平衡到的条件。在前述实施方案中，期望病毒物质可为脂质包膜病毒、非脂质包膜病毒、噬菌体、假病毒或病毒样颗粒物质。期望病毒可为天然或重组来源的。在每个前述实施方案的一个或多个中，所述样品可为没有预先纯化的。在每个前述实施方案的一个或多个中，所述样品可在实施本专利技术之前浓缩。在每个前述实施方案的一个或多个中，所述样品可已通过超滤被浓缩。在每个前述实施方案的一个或多个中，所述样品可已经历先前纯化步骤达到中间纯度水平或高纯度水平。在每个前述实施方案的一个或多个中，所述样品的中间纯度水平可在约40%至约90%纯度的范围或更大。在每个前述实施方案的一个或多个中，所述样品的高纯度水平可为约90%或更大。在每个前述实施方案的一个或多个中，所述样品体积可小于所述填充的色谱柱内的带负电的多孔颗粒的颗粒间空间的90%。在每个前述实施方案的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化包含期望病毒的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供包含带负电的多孔颗粒的填充的色谱柱，(ii)将所述填充的色谱柱平衡到使所述样品中的期望病毒待洗脱的条件，(iii)使所述样品与所述填充的色谱柱接触，使得被施加的样品体积小于或等于所述填充的色谱柱内的所述带负电的多孔颗粒的颗粒间空间，(iv)从所述填充的色谱柱洗脱病毒蛋白质，其中所述期望病毒处于更纯的状态且处于所述填充的色谱柱被平衡到的条件。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得·加尼翁，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG