一种比伐卢定的高效合成方法技术

本发明专利技术公开了一种比伐卢定的高效合成方法，包括如下步骤：以2‑Cl‑Resin为起始树脂载体，通过固相合成法，并采用特异性微波技术反应，依次连接比伐卢定序列中相对应的氨基酸，得到比伐卢定‑2‑Cl‑Resin；将比伐卢定‑2‑Cl‑Resin进行切割、沉降反应，得到比伐卢定粗肽；将比伐卢定粗肽进行反相高效液相色谱法纯化，冻干，得到比伐卢定纯品。本发明专利技术制备的比伐卢定，称量后经分析计算，目标纯品比伐卢定的纯度为99％，其纯品收率为65.8％，与现有技术相比较，产品收率有大幅度地提高，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产比伐卢定产品的广泛应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于多肽药物合成
，特别是涉及一种比伐卢定的高效合成方法。
技术介绍
比伐卢定(Bivalirudin)是一种白色或类白色结晶性粉末，其序列为D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH，分子式为C98H138N24O33，分子量为2180.33。比伐卢定合成的二十肽水蛭素衍生物，是直接的、特异的、可逆的凝血酶抑制剂，通过抑制凝血酶的活性位点而起效。冠心病作为常见心血管疾病之一，当出现冠状动脉内斑块破裂以及血栓等情况时，发病时间较快，这也是人们常说的畸形心肌梗死。过去往往是通过抗凝药肝素进行预处理，但肝素存在诱导血小板减少及肝素抵抗的局限性，比伐卢定作为一只新型抗凝药，具有抗凝效果的可预测性、不诱导血小板减少及对纤维蛋白结合的凝血酶有效等优势，克服了肝素、水蛭素的局限性，具有广泛的应用前景。现有的比伐卢定合成方法，CN201210428012.5及CN201510776607.3等采用片段合成法，CN201110162887.0及CN200910028793.7等采用液相合成法，均以片段合成法为主要步骤，合成周期长，需要经过多步切割反应、工艺复杂，生产成本高，不利于比伐卢定的大规模生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种比伐卢定的高效合成方法，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产比伐卢定产品的广泛应用前景。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种比伐卢定的高效合成方法，包括如下具体步骤：(1)、以2-ClResin为起始树脂载体，通过固相合成法，依次缩合比伐卢定序列中相对应的氨基酸，缩合产物产物采用特异性微波技术反应，得到比伐卢定-2-Cl-Resin；(2)、将比伐卢定-2-Cl-Resin进行切割、沉降反应，得到比伐卢定粗肽；(3)、将比伐卢定粗肽进行反相高效液相色谱法纯化，冻干，得到比伐卢定纯品。进一步地，步骤(1)中所述2-ClResin的取代度为0.64mmol/g。进一步地，所述步骤(1)中缩合反应以DIC/HOBt为活化剂和缩合剂，缩合反应时间为25-30min。进一步地，步骤(1)中所述特异性微波反应技术步骤为：缩合反应进行15-20min后，将Fmoc-比伐卢定-2-ClResin使用特异性的微波合成反应20s。进一步地，步骤(1)中所述固相合成法缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Phe-OH，缩合反应中氨基酸投料量为2-3倍所投树脂摩尔数，缩合反应温度为25℃。进一步地，步骤(1)中所述脱除保护基反应中的脱保护试剂为20％哌啶/DMF溶液，洗脱时间为20min。进一步地，步骤(2)所述切割沉降反应步骤为：树脂切割两次，将切割试剂吹入到冰乙醚中，离心沉淀去上清，重复操作3次得到比伐卢定粗肽产品。进一步地，所述切割试剂为TFA、水和TIS的混合溶液，其中，所述TFA、水和TIS的体积比为38：1：1，所述切割试剂体积为反应器容积的1/2。进一步地，步骤(3)所述反相高效液相色谱法纯化，纯化选用C18，10um制备柱，以A相：0.1％TFA/水，B相：0.1％TFA/乙腈为流动相，以B.Cone/％(2→55)，Time.0→30min的梯度程序进行多肽的分离提纯。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术制备的比伐卢定，称量后经分析计算，目标纯品比伐卢定的纯度为99％，其纯品收率为65.8％，与现有技术相比较，产品收率有大幅度地提高，该合成方法反应条件温和、反应效率高、成本低、具有生产比伐卢定产品的广泛应用前景。具体实施方式本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1S1、2-Cl-Resin的溶胀称取2-Cl-Resin1g从开口端加入至多肽合成反应器中，于多肽合成反应器中加入DCM溶液浸没2-Cl-Resin，溶胀30min后抽干溶剂；其中，2-Cl-Resin取代度为0.64mmol/g；S2、比伐卢定-2-Cl-Resin的合成比伐卢定-2-Cl-Resin为：(D-Phe)-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-2-Cl-Resin本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1～20个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表1所示：表1本专利技术中一些常用的缩写具有以下含义：Fmoc：芴甲氧羰基DMF：N,N-二甲基甲酰胺DCM：二氯甲烷Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰Pip：六氢吡啶TFA：三氟醋酸tBu：叔丁基OtBu：氧叔丁基Trt：三苯甲基DIC：N,N-二异丙基碳化二亚胺DIEA：N,N-二异丙基乙胺HOBt：1-羟基苯并三唑TIS：三异丙基硅烷S2-1、Fmoc-Leu-2-Cl-Resin的合成方法称取110mg的保护氨基酸Fmoc-Leu-OH和115mgHOBT加入10mL离心管中，同时加入3mLDCM溶液溶解，于该离心管中用滴管滴入适量催化剂DIEA溶液，活化20s；将活化后的溶液与S1中溶胀后的2-Cl-Resin混合后加入至多肽合成反应器中反应50min，反应结束后抽干溶剂，得到Fmoc-Leu-2-Cl-Resin；S2-2、Fmoc-Leu-2-Cl-Resin的封头反应方法配制脱保护溶液，所述脱保护溶液为甲醇与DIEA的混合溶液，其中，甲醇与DIEA溶液的体积比1:1，将5mL脱保护溶液与Fmoc-Leu-2-Cl-Resin加入至多肽合成反应器中封掉树脂上的反应活性位点，将多肽合成反应器置于20-30r/min的摇床上摇动20min；S2-3、树脂的洗涤方法用真空泵抽干多肽合成反应器中的脱保护溶液，同时加入DMF溶液洗涤树脂，所述DMF溶液加入体积为多肽合成反应器体积的1/3-1/2，将多肽反应器置于脱色摇床上摇动60s，抽干DMF溶液，重复操作3次；S2-4、Fmoc保护基的脱除方法于S2-3的多肽合成反应器中加入20％哌啶/DMF脱保护溶液脱除氨基保护基FMOC，其中，所述20％哌啶/DMF脱保护溶液体积为多肽合成反应器体积的20％-30％；将多肽合成反应器置于30r/min的脱色摇床上摇动反应20min，反应结束后，抽干溶剂；S2-5、保护氨基酸的活化方法称取572mg保护氨基酸Fmoc-Tyr(tBu)-OH和115mgHOBT加入10mL离心管中，同时加入3mL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种比伐卢定的高效合成方法，其特征在于，包括如下具体步骤：(1)、以2‑Cl Resin为起始树脂载体，通过固相合成法，以Fmoc‑保护氨基酸为缩合原料，依次缩合比伐卢定序列中相对应的氨基酸，缩合产物采用特异性微波技术反应，反应结束后脱除保护基，纯化并冻干，得到比伐卢定‑2‑Cl‑Resin；(2)、将比伐卢定‑2‑Cl‑Resin进行切割、沉降反应，得到比伐卢定粗肽；(3)、将比伐卢定粗肽进行反相高效液相色谱法纯化，冻干，得到比伐卢定纯品。

【技术特征摘要】
1.一种比伐卢定的高效合成方法，其特征在于，包括如下具体步骤：(1)、以2-ClResin为起始树脂载体，通过固相合成法，以Fmoc-保护氨基酸为缩合原料，依次缩合比伐卢定序列中相对应的氨基酸，缩合产物采用特异性微波技术反应，反应结束后脱除保护基，纯化并冻干，得到比伐卢定-2-Cl-Resin；(2)、将比伐卢定-2-Cl-Resin进行切割、沉降反应，得到比伐卢定粗肽；(3)、将比伐卢定粗肽进行反相高效液相色谱法纯化，冻干，得到比伐卢定纯品。2.根据权利要求1所述的一种比伐卢定的高效合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述2-ClResin的取代度为0.64mmol/g。3.根据权利要求1所述的一种比伐卢定的高效合成方法，其特征在于：所述步骤(1)中缩合反应以DIC/HOBt为活化剂和缩合剂，缩合反应时间为25-30min。4.根据权利要求1所述的一种比伐卢定的高效合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述特异性微波反应技术步骤为：缩合反应进行15-20min后，将Fmoc-比伐卢定-2-ClResin使用特异性的微波合成反应20s。5.根据权利要求1所述的一种比伐卢定的高效合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述固相合成法缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(Ot...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈为光，孙良玉，张旭光，严磊，刘金平，
申请(专利权)人：合肥国肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34