一种胰岛素的固相合成方法技术

本发明专利技术公开一种胰岛素的固相合成方法，包括以下步骤：以Fmoc固相合成法分别合成胰岛素的A链和B链，其中半胱氨酸分别采用不同侧链保护基的原料进行缩合反应，A链采用片段缩合法合成，得到裸肽肽链；然后采用液相环化法分别形成胰岛素的第一对二硫键、第二对二硫键和第三对二硫键，得到胰岛素纯品多肽。本发明专利技术通过工艺优化，胰岛素纯品纯度到达90％，纯品收率达到10％以上，大大提高了胰岛素的得率；本发明专利技术操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，产品收率高，利于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于多肽药物制备方法
，特别涉及一种胰岛素的固相合成方法。
技术介绍
中文名：胰岛素英文名：Insulin分子式：C257H383N65O77S6分子量：5807.69结构式：A链:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN；B链:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT胰岛素(Insulin)是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性生物合成人胰岛素(现阶段临床最常使用的胰岛素)其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同，主要用来糖尿病治疗，具有有效控制血糖，保护胰岛β细胞功能，预防、延缓糖尿病并发症的发生，提高患者生活质量，都具有极其重要的意义。胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共16种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。目前市场上现有的胰岛素合成制备方法较少，且收率极低(不足5％)，不能满足市场需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种纯度高，收率高，工艺简单的胰岛素固相合成方法，合成制备得到的胰岛素纯品纯度达到90％，纯品收率达到10％以上，适用于胰岛素的规模化生产。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种胰岛素的固相合成方法，该方法包括以下顺序的合成制备步骤：(1)、采用Fmoc固相合成法，将溶胀、脱保护并洗涤后的树脂载体与活化的保护氨基酸溶液于30℃的恒温震荡器中反应40-90min，其中，半胱氨酸分别采用mmt、acm和trt保护基的原料进行缩合反应，依次接入肽链序列中相对应的保护氨基酸，A链采用片段缩合法合成，得到A链片段一、A链片段二和B链裸肽肽链如下；A链片段一：LYQLENYC(Trt)NA链片段二：GIVEQC(Mmt)C(Acm)TSIC(Mmt)SB链裸肽：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(2)、将A链片段二裸肽纯化、冻干，然后进行液相环化，形成胰岛素的第一对二硫键；(3)、将A链片段一和片段二进行缩合反应，得到A链裸肽肽链，将纯化后的A链裸肽和B链裸肽分别溶解，进行液相环化，形成胰岛素的第二对二硫键；(4)、将形成第二对二硫键胰岛素多肽进行纯化、冻干，样品溶解后进行液相环化，形成胰岛素的第三对二硫键，将得到的样品纯化、冻干，得到胰岛素产品。步骤(1)中所述的树脂载体，片段一采用WangResin，片段二和B链采用2-Cl(Trt)-ClResin，所述保护氨基酸的活化方法为：将保护氨基酸和HOBt加入到离心管中，加入DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解；所述半胱氨酸的保护基，其中形成胰岛素第一对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(mmt)-OH，形成胰岛素第二对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(acm)-OH，形成胰岛素第三对二硫键的半胱氨酸采用Fmoc-Cys(trt)-OH。步骤(2)中所述的液相环化法，首先以特有的切割试剂配方7％TFA+87％DCM+2.5％Tis+2.5％H2O+1％EDT，洗脱除去半胱氨酸的mmt保护基，然后采用过氧化氢环化法反应，形成胰岛素的第一对二硫键。步骤(3)中所述的液相环化法，方法为将DTNP加入到纯化后的B链溶液中，于25℃条件下反应30min，然后将完成片段缩合并纯化后的A链加入到上述反应液中，搅拌反应30min，形成胰岛素的第二对二硫键。步骤(4)中所述的液相环化法，方法为将胰岛素的形成第二对二硫键的胰岛素多肽纯化，取冻干后的样品溶解，加入到饱和的碘溶液中，避光条件下反应30min，然后将Vc溶液加入反应体系中至溶液无色，反应终止，形成胰岛素的第三对二硫键，将样品纯化并冻干，得到胰岛素纯品多肽。本专利技术的有益效果：本专利技术通过工艺优化，胰岛素纯品纯度到达90％，纯品收率达到10％以上，大大提高了胰岛素的得率；本专利技术操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，产品收率高，利于工业化生产。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细描述。本专利技术合成制备胰岛素，通过固相合成法依次缩合胰岛素肽链序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，经活化剂和缩合剂缩合反应及脱保护剂的脱保护反应，得到胰岛素裸肽肽链，缩合反应中氨基酸投料量为所投树脂摩尔数的2-4倍，缩合反应温度为20-40℃。缩合反应所使用的活化剂和缩合剂分别为DIC、HOBt，缩合反应时间为20-50min；脱保护剂为20％哌啶/DMF的混合溶液，洗脱时间为15-30min。通过采用特殊的半胱氨酸原料，以特有的环化方法分别形成胰岛素的三对二硫键，样品纯化并冻干，到胰岛素纯品多肽。实施例一胰岛素裸肽肽链的合成本专利技术中一些常用的缩写具有以下含义：树脂的脱保护以及洗涤方法将树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将脱保护溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。1、A链片段一的合成A链片段一肽链为：L(D10)YQL(D10)ENYC(Trt)N称量取代度为0.96mmol/g的WangResin1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀2h。(1)Fmoc-Asn(trt)-WangResin的合成秤取50mgFmoc-Asn(trt)-OH用10mlDMF溶解均匀，将溶液加入到反应器中，再依次加入0.488mlDIC，1mgDMAP，60mgHOBT和0.06mlDIEA，反应器置于恒温振荡器中中反应1h，反应温度30℃。(2)Fmoc-Asn(trt)-WangResin的封头反应配制醋酐：DIEA＝1:1(体积比)的混合液6ml，将其加入到抽干的反应器中，置于恒温振荡器中反应30min。(3)脱除Fmoc保护基用DMF洗涤树脂，然后加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF脱保护溶液到抽干的反应器中，置于30r/min的脱色摇床上摇晃反应20min。(4)保护氨基酸的活化方法以Fmoc-Cys(Trt)-Asn(trt)-WangResin的缩合为例，称取65mgFmoc-Cys(Trt)-OH和60mgHOBT用10mlDMF溶解，再用滴管向溶液中加0.4mlDIC活化，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。(5)A链片段一的合成将上述活化的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于30℃的恒温震荡器中反应40-50min，洗涤，脱保护，洗涤。采用上述同样方法，依次缩合第2-9个Fmoc-保护氨基酸，即得到A链片段一。2、A链片段二的合成A链片段二肽链为：GIVEQC(Mmt)C(Acm)TSIC(Mmt)S称量取代度为0.64mmol/g的2-Cl-Resin1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于，该方法包括以下顺序的步骤：(1)、以Fmoc固相合成法分别合成胰岛素的A链和B链，其中半胱氨酸分别采用mmt、acm和trt保护基的原料进行缩合反应，A链采用片段缩合法合成，得到A链片段一、A链片段二和B链裸肽肽链；(2)、将A链片段二裸肽纯化、冻干，然后进行液相环化，形成胰岛素的第一对二硫键；(3)、将A链片段一和片段二进行缩合反应，得到A链裸肽肽链，将纯化后的A链裸肽和B链裸肽分别溶解，进行液相环化，形成胰岛素的第二对二硫键；(4)、将形成第二对二硫键胰岛素多肽进行纯化、冻干，样品溶解后进行液相环化，形成胰岛素的第三对二硫键，将得到的样品纯化、冻干，得到胰岛素产品。

【技术特征摘要】
1.一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于，该方法包括以下顺序的步骤：(1)、以Fmoc固相合成法分别合成胰岛素的A链和B链，其中半胱氨酸分别采用mmt、acm和trt保护基的原料进行缩合反应，A链采用片段缩合法合成，得到A链片段一、A链片段二和B链裸肽肽链；(2)、将A链片段二裸肽纯化、冻干，然后进行液相环化，形成胰岛素的第一对二硫键；(3)、将A链片段一和片段二进行缩合反应，得到A链裸肽肽链，将纯化后的A链裸肽和B链裸肽分别溶解，进行液相环化，形成胰岛素的第二对二硫键；(4)、将形成第二对二硫键胰岛素多肽进行纯化、冻干，样品溶解后进行液相环化，形成胰岛素的第三对二硫键，将得到的样品纯化、冻干，得到胰岛素产品。2.根据权利要求1所述的一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述的A链片段缩合中，片段一指C端1-9个氨基酸组成的肽链片段，片段一指C端10-21个氨基酸组成的肽链片段；片段一的合成固相载体选用WangResin，片段二和B链的合成固相载体选用2-Cl(Trt)-ClResin。3.根据权利要求1所述的一种胰岛素的固相合成方法，其特征在于：步骤(1)中Fmoc固相合成法中活化的保护氨基酸溶液方法为：将保护氨基酸和HOBt加入到离心管中，加入DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解得到活化的保护氨基酸溶液。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈为光，郑范娜，武兴伟，
申请(专利权)人：合肥国肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34