本发明专利技术公开一种胰岛素类似物的化学合成方法，包括片段合成、片段缩合、还原复性和纯化四个步骤，将胰岛素类似物的A链和B链分片段合成，第一个二硫键氧化时，将A链中Cys-Asn和B链先氧化在一起，由于Cys-Asn二肽价格低廉，分子间氧化时，二肽可大大过量，以提高分子间氧化效率，而在过量的氧化二肽，由于没有其他活性基团，可用强还原途径回收二肽，从而解决分子间二硫键氧化得率低的问题，通过片段缩合方法得到的AB链已经在一起的胰岛素前体，其结构与C链在的情况下的胰岛素类似，通过一定条件下的谷胱甘肽氧化-还原体系进行复性，得到得率很高的胰岛素。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种胰岛素类似物的化学合成方法。
技术介绍
糖尿病是一种常见的多发性代谢疾病，胰岛素为重要的内分泌激素，是治疗糖尿病的特效多肽激素化合物。而人胰岛素容易出现血糖波动、注射时间不灵活等问题,为了解决这些问题,科学家通过改变人胰岛素的分子局部结构,研发出了获得更佳作用时间和作用效果的胰岛素类似物。现有胰岛素类似物的合成方法以发酵法和合成法为主，发酵法是通过发酵合成胰岛素原，再经还原复性，变成胰岛素前体，用蛋白酶切除C链，变成胰岛素，用化学合成的方法，加入修饰基团；缺点：由于胰岛素上有3个反应活性氨基，所以在加入修饰基团的时候，很容易把3个活性反应氨基同时修饰，导致产品的得率低、纯度低。合成法：（1）胰岛素合成的最早方法是中科院合成的结晶牛胰岛素，常规的方法都是通过分别合成胰岛素的A链和B链，然后通过还原复性的方法形成胰岛素，但由于胰岛素的复性过程需要C链参与；缺点：在缺少C链参与的反应情况下，复性的产率极低，无生产价值；（2）后续改进了合成工艺，通过分别采用不同的保护基团保护胰岛素的6个半胱氨酸，然后采用一次脱保护的方法，形成3个二硫键；缺点：该方法合成胰岛素得率太低，没有实际生产价值，主要是因为3个二硫键通过化学方法氧化时需引入3种脱保护机制完全不同的保护基团，保护基团的价格昂贵，生产出来的产品成本高，另一方面，氧化过程需3次才完成，尤其在A链和B链二硫键环化的时候，由于是分子间环化，形成AA链、BB链、AB链的概率基本一致，造成得率偏低，虽然可以将AA链、BB链重新打开后再环化，但由于AA链和BB链都是大分子，在打开二硫键的同时会引入其它活性及软的修饰，导致最后的合成失效。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种得率高、纯度高、便于产业化生产的胰岛素类似物的化学合成方法。本专利技术的技术方案为：一种胰岛素类似物的化学合成方法，胰岛素类似物包括A链和B链，其中A链序列为GIVEQCCTSICSLYQLENYCN,B链序列为FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T，其合成步骤包括片段合成、片段缩合、还原复性和纯化四个步骤：（1）片段合成：将A链序列分成CN片段、GIVEQCCTSICSLYQLENY片段分别合成，B链序列分成SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T片段、FVNQHLCG片段分别合成, CN片段采用液相合成二肽Cys-Asn，GIVEQCCTSICSLYQLENY片段采用Fmoc固相合成法合成保护多肽Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH， SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T片段采用固相合成法合成N端保护侧链游离的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T，FVNQHLCG片段采用Fomc固相合成法合成全保护多肽片段Boc-FVNQHLCG-COOH；（2）片段缩合：步骤（1）中Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T游离的-SH和二肽Cys-Asn中游离的巯基通过二硫键氧化缩合成中间体1，中间体1和Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH通过酰胺键缩合成中间体2，中间体2通过脱保护剂脱去Fmoc之后再与Boc-FVNQHLCG-COOH缩合成中间体3，中间体3通过TFA脱去所有的保护基团得到胰岛素前体；（3）还原复性：将步骤（2）中胰岛素类似物前体溶于谷胱甘肽的复性液中，复性1-5天，得到胰岛素类似物粗品；（4）纯化：将步骤（3）得到的胰岛素粗品再经过HPLC纯化，得到高纯度胰岛素类似物。优选的，其步骤（1）由以下步骤组成：（a1）用Boc-Cys(Trt)-OH和Asn液相合成二肽Cys-Asn；（b1）提供一树脂作为固相支持物，用Fmoc固相合成方法合成全保护的FmocSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T，并用TFA裂解得到氨基端为Fmoc，侧链游离的Fmoc SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T；（c1）提供一树脂作为固相支持物，用Fmoc固相合成方法合成全保护的Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH片段；（d1）提供一树脂作为固相支持物，用FMOC固相合成方法合成全保护的Boc-FVNQHLCG-COOH片段。优选的，其步骤（2）由以下步骤组成：(a2)N端保护侧链游离的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T中游离的-SH和Cys-Asn中游离的巯基通过氧化剂氧化成二硫键，氧化缩合后的中间体1在反应液中析出，干燥后待用；（b2）中间体1溶于DMF中，加入经步骤（c1）活化好的氨基端为保护基团Fmoc或Boc的GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH，反应12小时，加水析出中间体 2，经硅胶柱一次纯化，再加入一脱保护剂脱去保护基团Fmoc或Boc，经硅胶柱二次纯化；（c2）中间体2溶于DMF中，加入经步骤（d1）活化好的氨基端为保护基团Fmoc或Boc的FVNQHLCG-COOH，反应12小时，加水析出中间体3，经硅胶柱进行纯化，再加入TFA脱去中间体3的所有保护基团，得到胰岛素前体。优选的，步骤（2）氧化缩合过程中Cys-Asn与N端保护侧链游离的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T的摩尔比介于5:1与500:1之间。本专利技术的有益效果：采用过量的二肽方法，将A链中Cys-Asn和B链先氧化在一起，由于Cys-Asn二肽价格低廉，分子间氧化时，二肽可大大过量，以提高环化效率，而在过量的环化二肽，由于没有其他活性基团，可用强还原途径回收二肽，从而解决分子间环化得率低的问题。通过片段缩合方法得到的AB链已经在一起的胰岛素前体，其结构与C链在的情况下的胰岛素类似，通过用生物合成是相似的谷胱甘肽还原复性方法，得到得率很高的胰岛素。具体实施方式：下面结合实施例对本专利技术作进一步说明：当R= Myr时，表示该胰岛素类似物为地特胰岛素，其合成步骤包括片段合成、片段缩合、还原复性和纯化四个步骤：（一）片段合成（1）A链序列CN片段合成：取46.4克BOC-Cys（trt）溶于1升DMF中，加入11.5克HOSU，搅拌5分钟，加入21克DCC，反应24个小时，过滤除去沉淀，加入10升冷水，析出产物，过滤干燥后，溶于1升DMF中；取25克Asn，加入200ml水溶液，加入三乙胺调节PH=9，把ASN水溶液加入上述的1升DMF中，反应24个小时，加水析出沉淀，用硅胶柱纯化，得到44.5克的BOC-Cys（trt）-Asn，将44.5克BOC-Cys（trt）-Asn加入1升50%TFA二氯甲烷溶液，反应2个小时，用乙醚沉淀得到20克二肽Cys-Asn；（2）A链序列BOC-GIVEQCCTSICSLYQLENY片段合成：取100克2-cl Trt树脂，用二氯甲烷溶胀后，加入溶于1升DMF中的Fmoc-Tyr（tbu）-OH138克，反应12个小时，用1升20%的哌啶DMF溶液，脱去Fmoc，取300克FMOC-Asn（trt）-OH、68克HOBT、161克TBTU，溶于1升DMF中，加入树脂，反应4个小时，用1升20%的哌啶DMF溶液，脱去fm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胰岛素类似物的化学合成方法，所述胰岛素类似物包括A链和B链，其中A链序列为GIVEQCCTSICSLYQLENYCN,B链序列为FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T，R为脂肪酸及其类似物包括但不限于（C8，C10，C12，C14，C16，C18），R1‑Glu(OH)‑OH，其特征在于：合成步骤包括片段合成、片段缩合、还原复性和纯化四个步骤：（1）片段合成：将A链序列分成CN片段、GIVEQCCTSICSLYQLENY片段分别合成，B链序列分成SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T片段、FVNQHLCG片段分别合成,所述CN片段采用液相合成二肽Cys‑Asn，所述GIVEQCCTSICSLYQLENY片段采用Fmoc固相合成法合成全保护多肽Boc‑GIVEQCCTSICSLYQLENY‑COOH，所述SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T片段采用固相合成法合成N端Fmoc保护侧链游离的Fmoc‑SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T，所述FVNQHLCG片段采用Fomc固相合成法合成全保护多肽片段Boc‑FVNQHLCG‑COOH；（2）片段缩合：步骤（1）中Fmoc‑SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T游离的‑SH和二肽Cys‑Asn中游离的巯基通过二硫键氧化缩合成中间体1，所述中间体1和Boc‑GIVEQCCTSICSLYQLENY‑COOH通过酰胺键缩合成中间体2，所述中间体2通过脱保护剂脱去Fmoc之后再与Boc‑FVNQHLCG‑COOH缩合成中间体3，所述中间体3通过TFA脱去所有的保护基团得到胰岛素类似物前体；（3）还原复性：将步骤（2）中胰岛素类似物前体溶于谷胱甘肽的复性液中，复性1‑5天，得到胰岛素类似物粗品；（4）纯化：将步骤（3）得到的胰岛素粗品再经过HPLC纯化，得到高纯度胰岛素类似物。...
【技术特征摘要】
1.一种胰岛素类似物的化学合成方法，所述胰岛素类似物包括A链和B链，其中A链序列为GIVEQCCTSICSLYQLENYCN,B链序列为FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T，R为脂肪酸及其类似物包括但不限于（C8，C10，C12，C14，C16，C18），R1-Glu(OH)-OH，其特征在于：合成步骤包括片段合成、片段缩合、还原复性和纯化四个步骤：（1）片段合成：将A链序列分成CN片段、GIVEQCCTSICSLYQLENY片段分别合成，B链序列分成SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T片段、FVNQHLCG片段分别合成,所述CN片段采用液相合成二肽Cys-Asn，所述GIVEQCCTSICSLYQLENY片段采用Fmoc固相合成法合成全保护多肽Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH，所述SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T片段采用固相合成法合成N端Fmoc保护侧链游离的Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T，所述FVNQHLCG片段采用Fomc固相合成法合成全保护多肽片段Boc-FVNQHLCG-COOH；（2）片段缩合：步骤（1）中Fmoc-SHLVEALYLVCGERGFFYTPK(R)T游离的-SH和二肽Cys-Asn中游离的巯基通过二硫键氧化缩合成中间体1，所述中间体1和Boc-GIVEQCCTSICSLYQLENY-COOH通过酰胺键缩合成中间体2，所述中间体2通过脱保护剂脱去Fmoc之后再与Boc-FVNQHLCG-COOH缩合成中间体3，所述中间体3通过TFA脱去所有的保护基团得到胰岛素类似物前体；（3）还原复性：将步骤（2）中胰岛素类似物前体溶于谷胱甘肽的复性液中，复性1-5天，得到胰岛素类似物粗品；（4）纯化：将步骤（3）得到的胰岛素粗品再经过HPLC纯化，得到高纯度胰岛素类似物。2.根据权利要求1所述的一种胰岛...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宇，
申请(专利权)人：漳州博欣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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